Кластерленген үзгүлтүксүз аралыктагы кыска палиндромдук кайталоолор (CRISPR) - бул жогорку өндүрүмдүүлүк натыйжалары менен дүйнөнү түп-тамырынан бери өзгөрткөн үчүнчү муундагы геномду түзөтүү ыкмасы. Ал ар кандай биологиялык ооруларды жана инфекцияларды дарылоо үчүн колдонулган. Ар кандай бактериялар жана башка прокариоттор (мисалы, археялар) да фагдардан коргонуу үчүн CRISPR/Cas9 системаларына ээ. CRISPR/Cas9га негизделген стратегиялар потенциалдуу түрдө өзгөргөн каршылык көрсөтүүчү гендерди, транскрипцияны жана эпигенетикалык жөнгө салууну бутага алуу менен үч эсе терс эмчек рагынын (TNBC) өсүшүн жана өнүгүшүн токтото алары кабарланган. Бул терапиялык кийлигишүүлөр TNBCде да байкалган дары-дармектерге туруктуулук сыяктуу татаал көйгөйлөрдү чечүүгө жардам бериши мүмкүн. Учурда CRISPR/Cas9ду максаттуу клеткаларга жеткирүү үчүн физикалык (микроинъекция, электропорация жана гидродинамикалык режимдер), вирустук (адено менен байланышкан вирус жана лентивирус) жана вирустук эмес (липосомалар жана липиддик нанобөлүкчөлөр). )-бөлүкчөлөр). TNBCнин молекулярдык себептерин изилдөө үчүн ар кандай моделдер иштелип чыкканы менен, геномду редакциялоо куралдарын in vivo жеткирүүнүн сезгич жана максаттуу ыкмаларынын жоктугу алардын клиникалык колдонулушун чектейт. Кыскача айтканда, бул серепте TNBC үчүн CRISPR/Cas9 дарылоонун прогресси, кыйынчылыктары, чектөөлөрү жана келечеги бар далилдерге негизделген ар тараптуу каралат. Ошондой эле, биз жасалма интеллект менен машиналык окутуунун айкалышы TNBCни дарылоодо CRISPR/Cas9 стратегияларын кантип жакшырта аларын баса белгилейбиз.
Рак клеткалардын контролсуз бөлүнүшү, клетка циклинин текшерүү пункттарынын бузулушу жана шишикти басуучу гендердеги (TSGs) мутациялар менен мүнөздөлөт (Matthews et al., 2022). Рактын ар кандай түрлөрүнүн арасында эмчек рагы аялдарда эң көп кездешкен рак түрү болуп саналат жана дүйнө жүзү боюнча өлүмдүн жогорку көрсөткүчүнө ээ (Waks and Winer, 2019). Эмчек рагы - гистологиялык жана биологиялык өзгөчөлүктөрү, клиникалык көрүнүшү жана жүрүм-туруму, ошондой эле дарылоого жооп берүү сыяктуу ар кандай мүнөздөмөлөргө ээ болгон гетерогендик оору (Weigelt et al., 2010). Эмчек рагын классификациялоо эмчек рагын диагноздоо жана шишиктин прогнозу боюнча так түшүнүктөрдү берет. Жалпы биомаркерлерди жана клиникалык-патологиялык өзгөчөлүктөрдү колдонуу эмчек рагын классификациялоонун негизги критерийи болуп келген (Tsang and Tse, 2019). Эмчек рагын дарылоонун прогнозуна жана реакциясына көптөгөн факторлор, анын ичинде эстроген рецепторунун (ER), прогестерон рецепторунун (PR), адамдын эпидермалдык өсүү факторунун 2-рецепторунун (HER2/neu) болушу жана гистологиялык даражасы, шишиктин түрү жана даражасы таасир этет. өлчөмү жана лимфа түйүндөрүнүн метастазы (Al-Tubaiti, 2020). Эмчек рагынын беш ички молекулярдык субтиптери аныкталган, анын ичинде люминалдык A, люминалдык B, HER2 менен байытылган, базальдык сымал жана клаудин-төмөн (Prat et al., 2015). TNBC - бул бардык ER, PR жана HER2 экспрессиясын көрсөтпөгөн рактын молекулярдык субтипи (Yin et al., 2020). Бул патологиялык өзгөчөлүктөр TNBC менен байланышкан, бул анын тез прогрессиясын жана башка эмчек рагынын түрлөрүнө караганда агрессивдүү мүнөзүн тастыктайт (Feng et al., 2018). Мындан тышкары, Peru et al. (2000) эмчек рагын кайра классификациялоо жана эмчек рагынын беш ички субтиптерин аныктоо үчүн микрочип технологиясын колдонушкан (Cadenas, 2012). Базальдык сымал эмчек рагы - бул үч терс фенотипке ээ жана тез прогрессия менен байланышкан эмчек рагынын субтипи. Белгилей кетүүчү нерсе, бардык базалдык сымал эмчек рагына көбүнчө TNBC диагнозу коюлат, бирок алардын 77% гана TNBC болуп саналат; Ал эми TNBCнин 71–91% базалдык сымал, бул эмчек рагынын бул эки түрү бири-бирине дал келип, ар кандай классификацияларды билдирерин көрсөтүп турат (Ванг Д.-Й. жана башкалар, 2019). Бул прогнозду тактоо жана учурдагы жана келечектеги дарылоого потенциалдуу жоопторду аныктоо үчүн TNBCнин гетерогендүүлүгүн мүнөздөө зарылдыгын жаратат. Мындан тышкары, TNBC эмчек рагынын бардык учурларынын 15–20% түзөт жана 50 жашка чейинки аялдарда көбүрөөк кездешет. BRCA1 же BRCA2 мутациялары TNBC учурларынын болжол менен 20%ында катталган (Xie жана башкалар, 2017; Tzikas жана башкалар, 2017). , 2020). Изилдөөлөр ошондой эле TNBCде кан тамыр эндотелийинин өсүү факторлорунун, шишик менен байланышкан макрофагдардын (TAM), шишикке инфильтрацияланган лимфоциттердин (TIL) жана шишиктин өсүшүнө жана миграциясына катышкан башка молекулалардын жогорку деңгээлин камтыган өзгөчө иммундук микрочөйрө бар экенин көрсөттү. Ошондуктан, TNBCнин микрочөйрөсүн түшүнүү анын прогноз жана дарылоо үчүн абдан маанилүү (Fan and He, 2022).
TNBCнин божомолун баалоо жана натыйжалуу дарылоону камсыз кылуу үчүн, негизинен ER, PR жана HER2 аныктоо үчүн иммуногистохимияга (IHC) жана эмчектин жаңы шишиктерин аныктоо үчүн маммографияга негизделген так диагноз коюу маанилүү. Бирок, маммография некроз жана фиброз сыяктуу шишик ичиндеги өзгөчөлүктөрдү жетиштүү деңгээлде чагылдыра албайт (Дипак Сингх жана башкалар, 2021). Начар прогноз жана диагноз дарыгерлерге туура дары-дармектерди жазып берүүгө тоскоол болгондуктан (Чаудхари, 2020), TNBC менен ооругандарга жардамды жакшыртуу үчүн ар кандай стратегиялар колдонулат. Учурда TNBC менен ооругандарда эки дары, доксорубицин жана циклофосфамид колдонулат жана жакшы натыйжаларды көрсөттү. Мындан тышкары, карбоплатин жана цисплатин сыяктуу башка платина препараттары колдонулат (Сиков жана башкалар, 2015). Мындан тышкары, Olaparib, Velaparib жана PF-01367338 сыяктуу PARP ингибиторлору TNBCни дарылоо үчүн потенциалдуу химиотерапиялык дарылар катары колдонулган (Ишино жана башкалар, 2018). Wnt/b-Catenin, NOTCH жана Hedgehog сигнал берүү жолдору TNBCнин пайда болушуна жана өрчүшүнө катышаары кабарлангандыктан, бул жолдорго дары-дармектерди багыттоо маанилүү стратегия болушу мүмкүн (Aysola et al., 2013). Хирургиялык операция, нур терапиясы жана химиотерапия бүгүнкү күндө TNBCни дарылоонун негизги каражаты бойдон калса да, максаттуу терапия, иммунотерапия, Cas9n, dCas9 сыяктуу CRISPRге байланыштуу ар кандай гендерди түзөтүү куралдары, CRISPR/Cas12, прайм-түзөтүү жана CRISPR/Cas9га багытталган ген терапиясы сыяктуу жаңы дарылоо ыкмаларын иштеп чыгууда олуттуу ийгиликтерге жетишилди. Бул жерде биз TNBCни дарылоодо колдонулган ар кандай CRISPRге байланыштуу гендерди түзөтүү куралдарына токтолобуз. Алардын ичинен CRISPR/Cas9 кеңири көңүл бурууга ээ болду.
Cas9n, ошондой эле Cas9 никаза деп да аталат, CRISPR/Cas9 геномун түзөтүү системасынан алынган Cas9 белогунун генетикалык жактан инженердик жол менен жасалган варианты (Gupta et al., 2019). Баштапкы түрүндө Cas9 белогу эки нуклеаза доменин камтыйт: RuvC жана HNH, алардын негизги функциясы эки ДНК жипчесинин бөлүнүшү. Бирок, Cas9n'да нуклеаза домендеринин бири HNH генетикалык жактан мутацияланып, активдүү болбой калат. Ошондуктан, Cas9n'дун HNH домени иштебей калат. RuvC домени гана активдүү бойдон калат, бул Cas9n'га бир ДНК жипчелеринде үзүлүштөрдү кесүүгө же түзүүгө мүмкүндүк берет (Trevino and Zhang, 2014). Cas9 менен салыштырганда, Cas9n максаттан тышкаркы таасирлерди натыйжалуу азайтып, клетканы калыбына келтирүү механизмдерин так жакшырта алат. Cas9n ар кандай көйгөйлөрдү чечүү үчүн колдонулушу мүмкүн, мисалы, кош жипчелүү ДНКдагы белгилүү бир жерлерде үзүлүштөрдү түзүү. Бул максатта эки Cas9n молекуласы бириктирилип, чогуу колдонулган (Yee, 2016). Аралаш линиялуу киназа 3 (MLK3) - бул TNBC метастаздары учурунда негизги жөнгө салуучу катары кызмат кылган митоген менен активдештирилген протеинкиназа (Cronan et al., 2012).
MLK3 TNBC метастазына алып келүүчү бир нече сигнал берүү жолдорун активдештире алат. Мисалы, c-Jun N-терминалдык киназа (JNK) жолу клеткалардын кыймылдуулугун жана клеткадан тышкаркы матрицанын деградациясын жөнгө салат, ал эми MLK3 JNK жолун активдештирет, ошону менен клеткалардын кыймылдуулугун жогорулатат жана инвазивдик касиеттерди берет (Rattanasinchai жана Gallo, 2016). MLK3 ошондой эле EMTди жөнгө салат. Бул үчүн ал Snail, Slug жана Twist сыяктуу транскрипциянын төмөнкү агым факторлорун активдештирет. Бул факторлор эпителий маркерлеринин экспрессиясын басаңдатат жана мезенхималык маркерлердин экспрессиясын күчөтөт, бул метастатикалык фенотиптин пайда болушуна алып келет (Casalino et al., 2023). MLK3 ECMди кайра түзүүдө жана ECMди деградациялаган матрицалык металлопротеиназалар (MMP) сыяктуу протеазалардын активдешүүсүндө роль ойной турганы байкалган. Бул шишик клеткаларынын инвазиясын жана алыскы жерлерге жайылышын жеңилдетет (Katari et al., 2019). Ошентип, мурунку изилдөөлөр MLK3 TNBCде маанилүү ролду ойной турганын көрсөттү. Раттанасинчай жана Галло MLK3түн ролун изилдөө үчүн TNBC моделдерин колдонушкан жана ал белгилүү бир сигнал берүү жолдору аркылуу рактын өнүгүшүнө өбөлгө түзөрүн аныкташкан. Алар MLK3тү редакциялоо үчүн CRISPR/Cas9n колдонушкан жана TNBC метастаздарынын олуттуу азайганын байкашкан (Раттанасинчай жана Галло, 2016).
dCas9, көбүнчө активдүү эмес Cas9 деп аталат, Cas9 белогунун модификацияланган туунду формасы. Активдүү Cas9дан айырмаланып, dCas9 эндонуклеаза активдүүлүгүнө ээ эмес, бул ДНКнын кош тизмектүү үзүлүшүн пайда кыла албайт. Ошондуктан, dCas9 ДНК ырааттуулугунда эч кандай өзгөртүүлөр же модификациялар болбостон геномдун белгилүү бир аймактарын так бутага алуу үчүн колдонулушу мүмкүн (Wang et al., 2016). dCas9да эки эндонуклеаза белогу, RuvC жана HNH, маанилүү аминокислота калдыктарын басуу менен инактивдештирилет. (Richter et al., 2016). ДНКны бөлүү активдүүлүгүнүн жоктугуна карабастан, dCas9 генетикалык изилдөөлөрдө жана биотехнологияда бир катар маанилүү ролдорду ойнойт. Мисалы, ал геномдун белгилүү бир аймактарын визуалдаштырууга мүмкүндүк берет, транскрипциялык жөнгө салууну жеңилдетет жана эпигенетикалык модификацияларды өбөлгө түзөт (Brocken et al., 2018).
Транскрипция фактору ZEB1 (цинк манжасынын E-кутучасын байланыштыруучу гомеобокс 1) эпителий-мезенхималык өтүүнү (ЭМӨ) жөнгө салууда өзгөчө жана маанилүү ролду ойнойт, бул эмбрионалдык өнүгүү, ткандардын калыбына келиши жана рактын өрчүшү учурунда пайда болгон клеткалык процесс. Ал эпителий клеткаларынын мезенхималык клеткаларга айлануусун камтыйт, натыйжада клетка морфологиясы, кыймылдуулугу, инвазивдүүлүгү ж.б. өзгөрөт (Wu et al., 2020). ZEB1 TNBCде эпителий клеткаларынын клетка-клетка адгезиясын жана полярдуулугун сактоо үчүн жооптуу болгон E-кадгерин жана Окклюдин сыяктуу бир нече эпителий маркерлерин ингибирлейт (Moreno-Bueno et al., 2008). Мындан тышкары, ZEB1 N-кадгерин, виментин жана фибронектин сыяктуу айрым маркерлерди активдештирет (Konradi et al., 2014) жана ошондой эле Rho GTPazaлары жана матрицалык металлопротеиназалар (MMPs) сыяктуу цитоскелеттик ремоделизацияга катышкан гендерди жөнгө салат (Huang). et al., 2014). 2022), мындан тышкары, ал ошондой эле ар кандай сигнал берүү жолдоруна, мисалы, өсүү фактору-β (TGF-β), Wnt сигнализациясы ж.б. таасир этет, ошону менен TNBCде шишиктин инвазиясын жана метастаздарын күчөтөт (Chen et al., 2016). Көптөгөн изилдөөлөр жана илимий далилдер ZEB1 TNBCди аныктоо жана терапиялык кийлигишүү үчүн баалуу агент катары чоң потенциалга ээ экенин көрсөтүп турат. Жакында жүргүзүлгөн бир изилдөөдө Waryah et al. TNBC моделин колдонуп, dCas9 тарабынан ZEB1ди толугу менен басууга жетишкен. Ошентип, алар in vivo шарттарында ZEB1дин өтө жогорку спецификалуулугун жана дээрлик толук ингибирлөөсүн байкашкан (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 – бул CRISPR/Cpf1 деп аталган генди түзөтүү куралы. Ал CRISPR/Cas системасынан келип чыккан, мында Cas12 термини CRISPR менен байланышкан 12 белокту билдирет (Bharathkumar et al., 2022), ал Cas9га толугу менен окшош. Бир гана айырмасы, анын курамында Cas12 белогу бар. Cas9 менен салыштырганда, Cas12 генди түзөтүү процессинде жабышкак учтарды пайда кылуу сыяктуу уникалдуу функцияларга ээ, ал эми Cas9 мокок учтарды пайда кылат (Wang et al., 2021). Cas12нин бул касиети анын ДНКны манипуляциялоонун өзгөчө технологиясына салым кошот. Максаттуу ДНКны так таанып жана кесе алган белок катары, ал укмуштуудай ар тараптуулукка ээ, бул аны генди түзөтүүнү кошо алганда, ар кандай колдонмолор үчүн натыйжалуу курал кылат (Pickar-Oliver жана Gersbach, 2019).
CRISPRдин башка варианттарына окшош, CRISPR/Cas12 TNBCдеги гендерди жок кылууга же активдештирүүгө жөндөмдүү, анын патогенезинде же дарылоого жооп кайтарууда маанилүү ролду ойногон гендерди бутага алат (Янг жана Чжан, 2023). Бул процессти ишке ашыруу үчүн Cas12ди максаттуу генге багыттаган жетектөөчү РНК (gRNA) иштелип чыккан. Cas12 өзүнүн максатына байланышкандан кийин, ал ДНКда кош тизмектүү үзүлүштөрдү киргизет жана ДНКны калыбына келтирүү механизмдерин активдештирет. Ремонт процессинде туура эмес нуклеотиддер киргизилиши мүмкүн, бул ген мутацияларына жана функциянын жоголушуна алып келет (Чжан жана башкалар, 2021a). Мындан тышкары, гендерди активдештирүү үчүн Cas12 ферментинин жакшыртылган версиясы (dCas12 деп аталат) да колдонулган. Аны транскрипция активатору менен айкалыштыруу менен, айрым гендерди индукциялап, ошону менен аларды активдештирүүгө болот. Бул технология шишикти басуучу гендерди активдештирүүнү күчөтүүдө чоң потенциалга ээ (Султан жана башкалар, 2022).
Прайм-редакциялоо – бул жаңыдан иштелип чыккан жана өтө жогорку сапаттагы геномду редакциялоо технологиясы. Ал организмдин ДНКсын абдан так өзгөртүүгө жөндөмдүү (Chen and Liu, 2023). Прайм-редакциялоо эки негизги компоненттин интеграциясы аркылуу ишке ашат: модификацияланган CRISPR/Cas9 ферменти жана тескери транскриптаза. CRISPR/Cas9 ферментинин ролу геномдогу так жерлерди тандап бутага алуу, ал эми тескери транскриптаза ДНКны максаттуу жерде толук өзгөртүүгө жардам берет (Hassan et al., 2021). Прайм-редакциялоо механизминде биринчи кадам праймер-редакциялоо боюнча колдонмо РНКны (pegRNA) түзүү менен байланыштуу (Standage-Beier et al., 2021). Ал максаттуу ДНКдагы каалаган редакциялоо жерине туура келген максаттуу ырааттуулукту жана РНК шаблонун камтыйт. Андан кийин pegRNA максаттуу клеткаларга праймер-редакциялоо нуклеазасы (PE2) менен кошо киргизилет. PE2 – бул Cas9 ферментинен, тескери транскриптазадан жана праймер-редакциялоо адаптеринен турган биригүү протеини (Martín-Alonso et al., 2021). Клетканын ичинде pegRNA жана PE2 комплекстери өзгөрткүсү келген белгилүү бир ДНКны издейт. Cas9 ферменти ДНКны кесип, бир жипчелерден турган шаблонду түзөт (Чой жана башкалар, 2022). Тескери транскриптаза бул шаблонду ДНКны түзөтүүгө даярдоо үчүн колдонот. ДНКны көчүрүү менен бирге РНК шаблонун түзөтүү боюнча көрсөтмөлөр да камтылган. Акырында, жаңы түзүлгөн ДНК жиби ДНКдагы үзүлүштү калыбына келтирүү үчүн шаблон катары колдонулат, натыйжада каалаган модификацияны камтыган өзгөртүлгөн ДНК ырааттуулугу пайда болот (Очоа-Санчез жана башкалар, 2021). Праймерди түзөтүү механизмдери гендердеги кеңири таралган мутацияларга алып келиши мүмкүн. Ал чекиттик мутацияларды, инсерцияларды, делецияларды жана ал тургай генди алмаштырууну бутага ала алат (Анзалон жана башкалар, 2019; Чен жана Лиу, 2023). Прайм-түзөтүү мурунку геномду түзөтүү технологияларына караганда бир катар артыкчылыктарды сунуштайт. Аларга тактыктын жогорулашы, максаттан тышкаркы таасирлердин азайышы жана ДНКнын кош жипчелүү үзүлүштөрүнө таянбастан ДНКны түзөтүү мүмкүнчүлүгү кирет (Анзалон жана башкалар, 2020).
CRISPR/Cas9 технологиясы башында бактерияларды плазмиданын которулушунан жана фаг инфекциясынан коргоо үчүн иштелип чыккан жана кийинчерээк геномду редакциялоо үчүн натыйжалуу РНКга негизделген ДНКны максаттуу курал катары кайрадан колдонула баштаган (Jiang and Doudna, 2017). Мындан тышкары, CRISPR/Cas9 системасы бактериялык жана архалдык геномдордун тиешелүүлүгүнө жараша 50% жана 87%ында бар экени кабарланган (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 - in vivo жана in vitro режимдерин колдонуу менен ар кандай анормалдуу генетикалык ырааттуулукту жок кылуу, киргизүү жана оңдоо үчүн потенциалдуу курал (Sabit et al., 2021). Андан тышкары, CRISPR/Cas9 кызыкчылык жараткан максаттуу гендерге спецификасын эске алганда, адаптациялык иммундук системанын бир бөлүгү экени көрсөтүлгөн (Chen and Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 Cas9 жана бир жетектөөчү РНКдан (sgRNA) турат. Cas9 - бир нече белок компоненттеринен турган эндонуклеаза. Мындан тышкары, Cas9 уникалдуу структуралык жана конформациялык касиеттерге ээ (Pacesa et al., 2022), анткени ал эки бөлүктөн турат: таануу (REC) жана нуклеаза (NUC). REC бөлүкчөсү андан ары үч аймакка бөлүнөт: REC1, REC2 жана көпүрө спиралдары (Cromwell et al., 2018). NUC үч бөлүктөн турат, атап айтканда RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH жана протоспейсердин жанаша мотивинин (PAM) өз ара аракеттенүү домени (1-сүрөт) (Song et al., 2016). sgRNA эки компоненттен турат, анын ичинде CRISPR РНКсы (crRNA) жана транскоддоочу кичинекей РНК (индикатор РНК) (1-сүрөт). sgRNA Cas9 протеинин коннексиндерге туташтырып, активдүү комплексти түзөт, ал эффектордук комплекс деп да аталат (Рихтер жана башкалар, 2012). crRNA - бул максаттуу ДНК тизмектерин таанууда маанилүү ролду ойногон 18–20 нуклеотиддик базалык жуп. Мындан тышкары, crRNA максаттуу ДНК менен жупташат, ал эми tracrRNA Cas9 нуклеазасынын максаттуу ДНКга байланышуусу үчүн таяныч катары кызмат кылат (Manghwar жана башкалар, 2019). Башка жагынан алганда, PAM тизмегинде 3 нуклеотид бар, бул эффектордук комплекстин ДНКга байланышын тастыктайт, көрсөтөт жана ортомчулук кылат. Cas9 протеиндик комплексинин RuvC жана HNH суббирдиктери каталитикалык активдүүлүккө ээ (Рихтер жана башкалар, 2012; Асмамав жана Завди, 2021). Cas9 суббирдигинин HNH нуклеаза домени crRNA менен байланышкан ДНК тизмегин бөлөт. RuvC нуклеаза домени башка ДНК жипчелерин үзүп, кош жиптүү үзүлүштөрдү (DSB) пайда кылат, андан кийин эки башка ДНК үзүлүшүн калыбына келтирүү механизми ишке кирет (Цзян жана Дудна, 2017) (1-сүрөт).
1-сүрөт. CRISPR/Cas9га сереп (A). CRISPR/Cas9 системасынын компоненттери: (i). Cas9 эндонуклеазасы максаттуу ДНК ырааттуулугун, (ii) crRNA жана tra-crRNA химераларынын биригишинен келип чыккан бир жол көрсөткүч (sg) РНКны кесүүгө жооптуу. (эки). Cas9 курамына Rec I, Rec II, NUC лоб (HNH жана Ruv C субкомпоненттер) жана тиешелүү функциялары бар PAM өз ара аракеттенүү домени (C) сыяктуу бир нече компоненттер кирет. CRISPR/Cas9 белок комплекси ДНК ырааттуулугун комплементардуу эмес жана комплементар формаларга бөлөт (D). CRISPR/Cas9 геномду үч этапта түзөт: таануу, кесүү жана калыбына келтирүү. Иштелип чыккан sg-РНК Cas9ду жетектеп, керектүү ырааттуулукту комплементардуу компонент crRNA аркылуу тааныйт. Cas9 PAM ырааттуулугун 5′-NGG-3′ деңгээлинде тааныйт жана ДНКны эритип, ДНК-РНК гибридин түзүп, бөлүнүүнү активдештирет. Cas9дун HNH домени комплементардуу тизмекти, ал эми RuvC домени комплементар эмес тизмекти бөлөт. CRISPR/Cas9 dsДНКны эки жол менен үзүү менен калыбына келтирет: гомологиялык эмес учтук бириктирүү (NHEJ) жана гомологияга багытталган калыбына келтирүү (HDR). NHEJ кош тизмектүү ДНКны бөтөн гомологиялык ДНК жок учурда ферменттик процесс аркылуу калыбына келтирет, бул катага жакын механизм кокустук ДНК ырааттуулугун киргизе же алып сала алат. HDR абдан спецификалык жана гомологиялык ДНК шаблондорун талап кылат.
CRISPR/Cas9 аркылуу оңдоо жолдоруна гомологиялык эмес учтардын кошулушу (NHEJ) жана гомологияга багытталган оңдоо (HDR) механизмдери кирет. NHEJ ката кетирүүгө жакын жол болуп саналат, анткени ал киргизүүнү же алып салууну камтыйт жана оңдоо механизми учурунда эч кандай үлгүнү талап кылбайт. Ал стандарттуу белокторду түзүү үчүн кокустук нуклеотиддерди колдонот (Abbasi et al., 2021). Бул оңдоо системасы KU комплекси, кайчылаш комплементациялоочу белок комплексинин 4-тиби (XRCC-4), ДНКнын учтук иштетүүчү ферменти жана белок киназасы ДНК-PKcs сыяктуу төрт комплекстен турат (Abbasi et al., 2021). KU комплексинин белогунун эки суббирдиги бар: Ku 70 жана Ku 80 жана NHEJ механизминде маанилүү ролду ойнойт, анткени калыбына келтирүү механизми эки суббирдиктин (Ku 70 жана Ku 80) максаттуу ДНКнын мокок же дээрлик мокок учтарына байланышуусу менен башталат (Abbasi et al., 2021), бул жаракат алган жерге NHEJге байланыштуу башка факторлорду тартуу үчүн каркас катары кызмат кылат (Yang et al., 2020). XRCC-4 жана ДНК лигазасы тиешелүүлүгүнө жараша 334 жана 911 аминокислотадан турат, ал эми XRCC4-ДНК лигаза IV комплекси ДНК учтарынын байланышын стимулдайт (Chatterjee et al., 2015). ДНКнын акыркы иштетүүчү ферменти, ошондой эле полинуклеотиддик киназа 3′-фосфат деп да аталат, ДНКнын акыркы иштетүүчү ферменти болуп саналат. Ал ДНКдагы 3′P тобун алып салып, DSB калыбына келтирүү учурунда 5′OH тобун фосфорлой алат. Ошондой эле, ал SSB оңдоо жолун колдонуу менен бир чынжырлуу үзүлүштөрдү (SSB) калыбына келтирүүнү камтыйт (Chatterjee et al., 2015). Протеинкиназа ДНК-PKcs - бул ДНКга көз каранды протеинкиназа, ал PIKKлердин (фосфатидилинозитол 3-киназага байланыштуу киназалар) каталитикалык суббирдигинен жана атаксия телангиэктазия мутацияланган (ATM) үй-бүлөсүнөн, ошондой эле ATM жана Rad3 менен байланышкан ATRлерден турат. чынжырлуу үзүлүштөр (DSBs) жана бир чынжырлуу үзүлүштөр (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR так жана ылайыктуу оңдоо механизми болуп саналат, анткени маалымат гомологиялык ДНК дуплексинин бүтүн формасын колдонуу менен көчүрүлөт, бирок ал эже-хроматиддердин катышуусун талап кылат. Бул сүт эмүүчүлөрдүн клетка циклинин S/G2 фазасында болот. HDR негизинен ачыткы түрлөрүндө пайда болот, бирок NHEJ сүт эмүүчүлөрдө абдан маанилүү (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Толук оңдоо механизми 1-сүрөттө көрсөтүлгөн.
TNBC генетикалык жана эпигенетикалык аномалиялардан улам пайда болгондуктан, CRISPR/Cas9 колдонуу менен залалдуу геномдук/эпигеномдук аномалияларды оңдоо акылга сыярлык терапиялык ыкма болушу мүмкүн (Chen et al., 2019). Мындан тышкары, клеткага мүнөздүү транскрипциялык жөнгө салууга катышкан кээ бир транскрипция факторлору рак клеткаларынын уникалдуу мүнөздөмөлөрүн көрсөтүшү мүмкүн, бул транскрипциялык жөнгө салуу ракты дарылоо үчүн эң сонун ыкма болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат (Drost et al., 2017). Дары-дармектерди иштеп чыгуу үчүн шишиктердин бул молекулярдык өзгөчөлүктөрүн, мисалы, генетикалык, эпигенетикалык жана транскрипциялык кемчиликтерди пайдалануу клиникалык натыйжаларды жакшыртып, скрининг чыгымдарын азайта алат. CRISPR - бул ракты пайда кылуучу геномдук буталарды аныктоо жана аныктоо үчүн гана эмес, ошондой эле адам клеткаларындагы онкогендерди түзөтүү, басуу жана эпигенетикалык жактан өзгөртүү үчүн да колдонулушу мүмкүн болгон потенциалдуу генди түзөтүү куралы (1-таблица) (Ahmed et al., 2021). Шишикти басуучулар, онкогендер жана дары-дармектерге туруктуулук менен байланышкан гендерди издөө үчүн бир нече CRISPR скринингдери жүргүзүлдү. CRISPR/Cas9ду ар кандай TNBC онкогендерин түзөтүү үчүн колдонуу 2-сүрөттө көрсөтүлгөн.
2-сүрөт. CRISPR/Cas9 колдонуу менен ар кандай TNBC онкогендеринин гендерин редакциялоо, натыйжада шишиктин өсүшү жана метастаздары азаят. Бул онкогендерге TNBCнин пайда болушуна жана метастазына катышкан CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 жана CXCR7, Crypto1, ROR1 жана ST8SIA кирет.
Рак клеткаларынын миграциясы, инвазиясы жана эпителий-мезенхималык өткөөл (ЭМТ) ITGA9 менен байланышкан. Мурунку изилдөөлөр ITGA9 Нотч жолунда негизги оюнчу экенин жана рабдомиосаркоманын метастазында кызыктуу ролду ойной турганын көрсөткөн (Molist et al., 2020). Мындан тышкары, ITGA9 эмчек рагын кошо алганда, бир нече шишик түрлөрүндөгү бейтаптардын прогнозуна тыгыз байланышта экени аныкталган (Wang Z. et al., 2019). Мындан тышкары, ITGA9дун биоинформатикалык анализи анын TNBCдеги экспрессиясы башка эмчек рагынын түрлөрүнө караганда бир кыйла жогору экенин көрсөттү. ITGA9 деңгээлинин жогорулашы TNBC бейтаптарында шишиктин метастазы жана кайталанышы менен байланыштуу. CRISPR/Cas9 тарабынан ITGA9дун нокауту рактын өзөк клеткаларына (CSC) окшош касиеттерге, шишик ангиогенезине, шишиктин өсүшүнө жана TNBCде β-катениндин деградациясын күчөтүү менен метастаздын азайышына алып келген (Wang Z. et al., 2019).
Крипто-1 TGF-β үй-бүлөсүнүн мүчөсү болуп саналат жана эмбриогенездин алгачкы этабы, өзөк клеткаларын сактоо жана рак метастаздары үчүн абдан маанилүү (Ишии жана башкалар, 2021). Tdgf-1 деп да белгилүү болгон бул онкогендик GPI менен байланышкан сигнал берүүчү белок, ал алгачкы тилкенин, мезодерманын жана эндодерманын пайда болушун жөнгө салууга, ошондой эле эмбриогенез учурунда дене органдарынын өнүгүшүндө сол/оң асимметриянын орношуна катышат (Чжан жана башкалар, 2021b). Мындан тышкары, Крипто-1 өзөк клетка маркери катары эпителий-мезенхималык өткөөлгө (ЭМӨ) катышаары көрсөтүлгөн (Чжан жана башкалар, 2021b). ЭМӨ эмбрионалдык өнүгүү, фиброз жана жарааттардын айыгуу сыяктуу ар кандай процесстер үчүн гана эмес, ошондой эле рактын инвазиясы жана метастаздары үчүн да абдан маанилүү. Мындан тышкары, Крипто-1 төрт Notch рецептору менен өз ара аракеттенип, алардын трансляциядан кийинки жетилүүсүн күчөтөөрү көрсөтүлгөн (Брэндштадтер жана Майлард, 2019). Notch сигнал берүү жолу адамдын эмчек рагынын клеткаларын сактоого катышаары белгилүү. Изилдөөлөр көрсөткөндөй, Crypto-1дин CRISPR/Cas9 аркылуу нокаутка учурашы рактын өсүшүн жана метастаздарын басат. Ошондуктан, Crypto-1 TNBC үчүн маанилүү терапиялык бутага айланышы мүмкүн (Castro et al., 2015).
XCL12 протеини жана анын хемокин рецептору CXC (CXCR4 жана CXCR7) рак клеткаларынын көбөйүшүндө, өсүшүндө, миграциясында жана инвазиясында ар кандай ролдорду ойнойт (Wu et al., 2015). Бул хеморецепторлор in vivo жана in vitro моделдеринде бир нече сигнал берүү жолдору аркылуу TNBCнин өнүгүшү менен байланышкан (Wu et al., 2015). Мындан тышкары, CXCR4 жана CXCR7 активдешүүсү TNBCде метастазга көбүрөөк чалдыгуу жана начар прогноз менен байланыштуу (Karn et al., 2022). Ошондуктан, CXCR4 жана CXCR7 нокауттары TNBCди кошо алганда, эмчек рагын дарылоодо натыйжалуу дары-дармек максаттуу гендерине айланышы мүмкүн. Ян жана башкалар тарабынан жүргүзүлгөн изилдөө. Ян жана башкалар (2019) CXCR4 жана CXCR7 гендерин биргелешип нокаут кылуу үчүн CRISPR/Cas9 колдонушкан жана TNBCнин көбөйүшү, өсүшү, миграциясы жана инвазиясы бир кыйла басаңдагандыгын аныкташкан (Yang et al., 2019).
Эмчек рагынын ткандарында TNBC онкогени болгон miR-3662 деңгээлинин жогорулаганы байкалган (Yi et al., 2022). miR-3662нин нокаундунун эмчек рагынын шишигинин өсүшүн жана метастазасын in vivo жана in vitro шартында басаңдатаары көрсөтүлгөн (Agarwal and Gupta, 2021). HBP-1 Wnt/-катенин сигнализациясынын күчтүү ингибитору болуп саналат жана TNBC клеткаларынын miR-3662 аркылуу өсүшүнө жооптуу болушу мүмкүн. Жакында эле, Йи жана башкалар miR-3662-HBP1 огу TNBC клеткаларындагы Wnt/-катенин сигнализация жолун жөнгө саларын аныкташкан (Yi et al., 2022). Шишикке мүнөздүү экспрессиясынан улам, miR-3662 TNBC үчүн потенциалдуу терапиялык максат болушу мүмкүн. Ошентип, miR-3662нин CRISPR/Cas9 аркылуу нокаундунун TNBCни дарылоо үчүн жаңы дары-дармектерди иштеп чыгуу үчүн эң сонун ыкма болушу мүмкүн.
UBR5 - бул 300 кДа нуклеофосфопротеин, ал ар кандай рак ооруларында шишиктин пайда болушунун, метастаздын жана иммундук жооптун негизги жөнгө салуучусу катары аныкталган (Ширер жана башкалар, 2015; Фу жана башкалар, 2023). UBR5тин TNBC үлгүлөрүндө жогорулаганы жана убиквитин лигаза активдүүлүгү аркылуу пролиферацияны индукциялоо менен ERα функциясын стимулдай турганы кабарланган (Болт жана башкалар, 2015). Баштапкы TNBC үлгүлөрүнүн экзомдук секвенирлөө боюнча бүтүндөй изилдөөлөрү UBR5тин экспрессиясынын жогорулаганын көрсөттү, бул анын TNBCнин өнүгүшүндөгү ролун көрсөтүп турат. Мындан тышкары, UBR5тин CRISPR/Cas9 аркылуу жок кылынышы эксперименталдык чычкан моделдеринде TNBC метастазынын жана өсүшүнүн олуттуу ингибирленишин көрсөттү. Андан тышкары, UBR5ти жапайы типтеги чычкан моделине кошуу анын толук функционалдуулугун калыбына келтирди, ал эми бул таасир инактивдештирилген мутант штаммдарда байкалган жок (Лиао жана башкалар, 2017). UBR5тин жетишсиздиги TNBCде апоптоздун, некроздун жана ангиогенездин начардыгынан улам шишиктин өсүшүнүн басаңдашы менен байланыштуу. UBR5тин жоголушунан улам шишиктин алыскы органдарга жайылышы азаят жана UBR5 негизинен E-кадгерин экспрессиясын азайтуу менен анормалдуу EMTди пайда кылат (Zhang and Weinberg, 2018). Жакында эле UBR5 TNBCде IFN-γ менен индукцияланган PDL1 транскрипциясында E3 убиквитиндештирүү активдүүлүгүнүн жоктугунан улам абдан маанилүү фактор экени көрсөтүлдү. РНК транскриптомунун анализи UBR5тин IFN-γ жолу менен байланышкан гендерге системалуу таасир этиши жана протеинкиназа РНКсынын (PKR) жана анын сигналдык трансдукторлорунун жана активаторлорунун активдешүү деңгээлин жогорулатуу менен PDL1 трансактивациясын күчөтүшү мүмкүн экенин көрсөттү. транскрипция 1 (STAT1) жана интерферонду жөнгө салуучу фактор 1 (IRF1). Бирок, CRISPR/Cas9 аркылуу UBR5 жана PD-L1 экспрессиясынын айкалышкан абляциясы эки блокадага тең караганда синергетикалык терапиялык таасирге ээ, шишиктин микрочөйрөсүнө терең таасир этет (Wu et al., 2022). Ошентип, CRISPR/Cas9 UBR5 функциясын ингибирлөөнүн, ошону менен TNBC метастазын жана шишиктин өсүшүн басуунун маанилүү куралы болушу мүмкүн.
ROR1 - бул рак жана эмбрионалдык өнүгүү учурунда экспрессияланган жана онкофеталдык белок катары аныкталган I типтеги трансмембраналык белок (Николас Борчердинг, 2014). Ар кандай адам рак ооруларынын инвазивдик жүрүм-туруму ROR1дин жогорулашы менен байланыштуу. ROR1ге багытталган терапиялык кошулмаларды камтыган in vivo жана in vitro изилдөөлөрүнөн келечектүү натыйжалар алынган (Chien et al., 2016). Эмчек тканынын биопсияларындагы ROR1 мРНКсынын жогорку деңгээли агрессивдүү базалдык сымал эмчек (BL) шишиктери жана алардын дененин башка бөлүктөрүнө миграциясы менен да байланыштуу болгон. Андан тышкары, ROR1дин ашыкча экспрессиясы TNBCнин өнүгүшүнүн прогностикалык белгиси катары аныкталган (Chien et al., 2016). Бирок, TNBCнин өсүшүн жана метастазын басуу үчүн CRISPR/Cas9 колдонуп ROR1ди басуу натыйжалуу стратегия болмок.
Сиалилдөө процесси гликоконъюгаттарга сиал кислотасын кошууну камтыйт, ал сиалилтрансферазалар (STs) тарабынан катализденет. ST8SIA1 ST үй-бүлөсүнө кирет жана лимфоциттик лейкемия жана жоон ичеги рагы сыяктуу ар кандай оорулардын патогенезинде маанилүү ролду ойнойт (Chang et al., 2018). РНК ырааттуулугун анализдөө ST8SIA1 TNBC бейтаптарынын эмчек ткандарында жогорку деңгээлде экспрессияланаарын жана TNBC патогенезине салым кошушу мүмкүн болгон шишикти басуучу p53 гениндеги мутациялар менен оң корреляцияга ээ экенин көрсөтөт (Battula et al., 2017). Мындан тышкары, ST8SIA1 TNBC метастазасына жана кайталанышына катышат, бул анын TNBC пайда болушунда жана өнүгүшүндө маанилүү ролду ойной тургандыгын көрсөтүп турат. TNBCнин in vitro моделинде CRIPSR/Cas9 тарабынан ST8SIA1ди нокдаун кылуу өсүштү жана метастазды бөгөттөй турганы көрсөтүлгөн (Battula et al., 2017). Бул CRISPR/Cas9 TNBC дарылоодо ST8SIA1 онкогенинин функциясын басуу үчүн маанилүү курал болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
NAT1 - II фазадагы ксенобиотикалык кошулмалардын пайда болушун катализдөөчү зат алмашуу ферменти жана дээрлик бардык адам ткандарында экспрессияланат. NAT1 ароматтык амин субстраты жок болгон учурда да ацетил-КоАны (ацетил-КоА) бутага алуу үчүн кофактор фолатты колдоно алат (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Изилдөөлөр көрсөткөндөй, NAT1 эмчек рагынын клеткаларынын моделдеринде матрицалык металлопротеиназа 9 (MMP9) функциясын жөнгө салат жана глюкоза ачкачылыгы учурунда реактивдүү кычкылтек түрлөрүнөн (ROS) коргойт (Wang et al., 2018). NAT1ди алып салуу пируватдегидрогеназа комплексин ингибирлеп, митохондриялык дисфункцияга алып келери көрсөтүлгөн (Wang L. et al., 2019). Мындан тышкары, башка ар кандай отчеттордо кичинекей молекулаларды жана siRNAны басууну колдонуу менен NAT1ди ингибирлөө эмчек рагынын клеткаларынын инвазивдүүлүгүн жана көбөйүшүн азайта алары көрсөтүлгөн (Stepp et al., 2018). Жакында эле CRISPR/Cas9 эмчек рагынын клетка линиясындагы MDA-MB-231де NAT1ди басуу үчүн колдонулган, бул анын экспрессия деңгээлине жараша клеткалык метаболизмге таасир этет. Бул изилдөө ошондой эле NAT-1 TNBCнин прогрессиясы жана метастазы үчүн маанилүү экенин көрсөттү (Carlisle et al., 2020).
Онкогендердин координацияланган транскрипциясы супер күчөткүчтөр, транскрипция факторлору жана кофакторлор менен жөнгө салынат (Hnisz et al., 2015). Мындан тышкары, транскрипциялык жөнгө салуу үчүн CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 жана CDK13 сыяктуу циклинге көз каранды киназалар (CDK) тобу талап кылынат. Алардын арасында CDK7 РНК-полимераза II фосфорлануусуна катышат, бул TNBC патогенезинде онкоген транскрипциясын баштоо жана кеңейтүү үчүн абдан маанилүү. Негизги изилдөөдө CRISPR/Cas9 тарабынан CDK7нин делециясы TNBCни ингибирлеген, бул TNBC патогенези CDK7ге көз каранды экенин көрсөтүп турат (Wang Y. et al., 2015).
Изилдөөлөр көрсөткөндөй, MYC жана RBPдеги (РНКны байланыштыруучу белок) мутациялар апоптозго алып келиши мүмкүн, ал эми MYC же RBPдеги бир гендик мутациялар рак клеткаларынын өсүшүнө таасир этпейт (Эйнштейн жана башкалар, 2021). Адам геномундагы 1000ден ашык RBP CRISPR/Cas9 негизиндеги китепкананы колдонуу менен текшерилген. Алардын ичинен 57 RBP MYC деңгээли жогору болгон рак клеткаларынын өсүшү үчүн абдан маанилүү экени аныкталган (Wheeler жана башкалар, 2020). Мындан тышкары, YTHDF2 TNBC клеткаларынын өсүшүн сактоо үчүн маанилүү жана MYC экспрессиясы жогору болгон рак клеткаларында жогорку деңгээлдеги транскрипция жана трансляция учурунда метилденген транскрипттердин көлөмүн азайтат. Мындан тышкары, YTHDF2 рак клеткалары үчүн маанилүү эмес, алар TNBC бейтаптарынын жашоо мөөнөтүн узартуу үчүн MYC деңгээлинин жогорулашына анча көз каранды эмес (Эйнштейн жана башкалар, 2021), бул TNBCни жеңе ала турган дары-дармектер үчүн потенциалдуу терапиялык максат болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Цинк манжа белоктору (ZNF) жалпы адам геномунун болжол менен 1% түзөт. Изилдөөлөр көрсөткөндөй, ZNF боор рагы, эмчек рагы жана жоон ичеги рагы сыяктуу ар кандай рак ооруларында клеткалардын көбөйүшүн жөнгө сала алат (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). CRISPR нокаутунан түзүлгөн китепканалар эмчек рагы клеткаларындагы ар кандай шишик басуучу гендерди (TSG) скринингдөө үчүн колдонулган (Shalem et al., 2014). Ошондон бери CRISPR/Cas9 ZNF319 тарабынан өчүрүлгөн эмчек рагы клеткаларынын транскриптомикалык изилдөөсү ZNF319 эмчек рагынын көбөйүшүн азайтуучу шишик басуучу ген экенин жана ошондуктан ар кандай потенциалдуу сигнал берүү механизмдерине жана башка биологиялык функцияларга катышаарын көрсөттү (Wang L. et al., 2022).
Ферроптоз – темирдин болушуна көз каранды болгон программаланган клетка өлүмүнүн бир түрү. Ферроптоздун өнүгүшүнө липиддик пероксиддердин болушу таасир этери белгилүү. Мындан тышкары, PKCβII эрте липиддик пероксидацияны көрсөтөөрү жана липиддик пероксидациянын жогорулашы ферроптоз менен байланыштуу экени кабарланган. CRISPR/Cas9 аркылуу киназа ингибиторлорунун китепканасын текшерүү PKCβII липиддик пероксидация процессине катышаарын көрсөттү, бул MDA-MB-231 клеткаларындагы ферроптоз үчүн абдан маанилүү (Zhang et al., 2022). Демек, бул CRISPR/Cas9 тарабынан PKCβII нокаутка учурашы ферроптозго байланыштуу ооруларды дарылоо үчүн потенциалдуу шишик басуучу гендин бута болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат (Zhang et al., 2022).
Дары-дармектерге туруктуулук рак менен ооругандардын өлүмүнүн болжол менен 90% ын түзөт деп эсептелет жана ракты дарылоодогу негизги көйгөйлөрдүн бири болуп саналат (Bukowski et al., 2020). Жыйынтыктар дары-дармектердин агып чыгышына, ДНКны калыбына келтирүүгө, апоптозго жана ар кандай клеткалык сигнал берүү жолдоруна байланыштуу жетиштүү сандагы гендердин дары-дармектерге туруктуулук менен байланышы бар экенин көрсөтүп турат (Haider et al., 2020). Алардын арасында бир нече гендер CRISPR/Cas9 куралдары менен бутага алынган жана дары-дармектерге туруктуулукту азайтууда жана ракка каршы дарылоонун натыйжалуулугун жогорулатууда келечектүү натыйжаларды көрсөтүшкөн (Vaghari-Tabari et al., 2022). Мындан тышкары, жогорку өндүрүмдүүлүктөгү CRISPR/Cas9 генинин нокаут скрининг китепканалары дары-дармектерге туруктуулуктун потенциалдуу генинин буталарынын функциясын өзгөртүүгө катышкан (Shalem et al., 2015). Паклитакселге туруктуулук гендерин аныктоо үчүн, кайталанган TNBC менен ооругандарда дарыга туруктуулук менен байланышкан гистон деацетилаза 9 (HDAC9) сыяктуу сегиз талапкер генди аныктоо үчүн РНК секвенирлөөсү геном боюнча sgRNA китепканасын скринингдөө менен айкалыштырылган. Башка бир изилдөөдө, ракка каршы дары-дармектер менен дарыланган TNBC бейтаптарынын жашоосу учурунда дизерин/треонин жана тирозин протеинкиназасынын (DSTYK) экспрессиясынын жогорулаганы байкалган. Андан тышкары, DSTYKтин CRISPR/Cas9 аркылуу нокдауну in vitro дарыга туруктуу рак клеткаларынын (SUM102PT клеткалары жана MDA-MB-468 клеткалары) жана in vivo TNBC моделинин апоптозун бир топ күчөткөн (Ogbu et al., 2021).
TNBC MAPK жолунун анормалдуу активдешүүсүнө ээ болсо да, MEKке багытталган терапиянын клиникалык таасири начар. CRISPR/Cas9 геномдук китепканасынын скрининги PSMG2 ингибирлөөсүнүн (протеом жыйындысынын шаперону 2) TNBC BT549 жана MB468 клеткаларын MEK ингибитору AZD6244кө сезгичтигин көрсөттү. PSMG2нин CRISPR/Cas9 нокдауну кадимки протеасома функциясын өзгөртүп, PDPK1дин аутофагия аркылуу бөлүнүшүнө алып келди, ошону менен AZD6244 (MEK ингибитору) жана MG132 (протеасома ингибитору) тарабынан индукцияланган TNBC чычкан моделдериндеги шишик клеткаларын андан ары жакшыртат. Ошентип, протеасома жана MAP киназа (MEK) ингибиторлору шишик клеткаларынын көбөйүшүн азайтуу үчүн синергетикалык түрдө колдонулушу мүмкүн (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 ошондой эле TNBCге туруктуулукка алып келүүчү ген функциясынын жоголушун скринингдөө үчүн колдонулган (Шу жана башкалар, 2020). Ге жана башкалар TNBCде BET бромодомен ингибитору (BBDI) JQ1 менен дарыланган рак клеткаларынын дарыга туруктуулук механизмин түшүндүрүшкөн. CRISPR/Cas9ду колдонуп, алар rb1 генин жок кылуу TNBCнин ракка каршы JQ1 дарысына туруктуу болушуна алып келерин аныкташкан. Ошондуктан, rb1 функциясы TNBCде JQ1 дарыларына жооп берүүдө маанилүү. Алар ошондой эле паклитаксел CDK4/6 киназа/микротүтүкчөлөрдүн ингибитору экенин жана анын JQ1 сыяктуу BBDIлер менен айкалышы дарыга туруктуу TNBCге келечектүү терапиялык жоопторду бере аларын билдиришкен (Ге жана башкалар, 2020).
Узун коддолбогон РНКнын (lncRNA) транскрипциялык ландшафты TNBCде неоадъюванттык терапияга туруктуулукка жооптуу экени кабарланган. Бул изилдөө беш башка MALAT1 lncRNA транскрипттери TNBCде жогорку деңгээлде экспрессияланаарын көрсөтүп турат. Мындан тышкары, MALAT1дин CRISPR/Cas9 аркылуу жок кылынышы TNBC BT-549 клеткаларынын паклитакселге жана доксорубицинге сезгичтигин жогорулаткан, бул TNBCде MALAT1ге туруктуулуктун потенциалдуу ролун көрсөтүп турат (Shaath et al., 2021).
BRCA1деги (BRCA1m) мутациялар гетерогендүү жана ошондуктан аныктоо кыйын. BRCA1дин синтетикалык өлүмгө алып келүүчү өнөктөшү болгон PARP1ди (поли(ADP-рибоза) полимераза) бутага алуу TNBC дарысынын хемосезгичтигин жогорулатышы мүмкүн. CRISPR/Cas9 колдонуу менен PARP1ди делециялоо доксорубицин, гемцитабин жана доцетаксел сыяктуу ракка каршы дарылардын mBRCA1 мутант TNBC клеткаларына сезгичтигин жогорулатты, бул PARP1дин TNBCдеги дарыга туруктуулукка да катышаарын көрсөтүп турат (Vaghari-Tabari et al., 2022). . BRCA1 же BRCA2 шишикти басуучу гендердеги мутациялар адамдарда эмчек рагынын пайда болуу ыктымалдыгын жогорулатары белгилүү. Бул бейтаптарды дарылоо PARP ингибиторлорун колдонууну талап кылат. Мындан тышкары, CRISPR/Cas9 колдонуу менен нуклеотидди сактап калуу фактору DNPH1ди нокауттоо уулуу нуклеотид 5-гидроксиметилдезоксиуридин (hmdU) монофосфатын жок кыла алары, ошону менен BRCA жетишсиз клеткалардын PARP ингибиторлоруна сезгичтигине болгон реакциясын күчөтөрү көрсөтүлдү (Fugger). Ошентип, CRISPR/Cas9 жана PARP1 ингибиторлору TNBC үчүн маанилүү дарылоо стратегиясына айланышы мүмкүн.
Пенетранттык гликопротеин (P-gp) гени - бул көп дарыга туруктуулук гени, ал жалпысынан бардык TNBCлердин болжол менен 41%ында жогорулайт (Sun et al., 2020). P-gp индукциялаган дары-дармектердин агып чыгышы эмчек рагындагы дарыга туруктуулуктун негизги жөнгө салуучусу катары аныкталган. P-gp ингибиторлору эмчек рагындагы ракка каршы дары-дармектерге сезгичтигинин жогорулаганын көрсөтүштү (Famta et al., 2021). Ошентип, CRISPR/Cas9 аркылуу P-gp жана P-gp ингибиторлорун абляциялоо же басуу TNBCдеги дарыга туруктуулукту жеңүүнүн абдан маанилүү ыкмалары болушу мүмкүн.
АТФ менен байланыштыруучу кассеталык ташуучу G2 (ABCG2) TNBCде дарыга туруктуулукту пайда кылары белгилүү (Palasuberniam et al., 2015), бирок учурда CRISPR/Cas9 жана ABCG2 үнсүздөшү менен шишикти басуучу гендин инактивдешүүсүнүн ортосундагы байланыш жөнүндө эч кандай маалыматтар жок. PTEN ABCG2 активациясын күчөтүшү мүмкүн (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Ошондуктан, ABCG2ди алып салуу үчүн CRISP/Ca9 колдонуу жана аны ABCG2 ингибитору менен айкалыштыруу TNBCде дарыга туруктуулукту жеңүү үчүн ылайыктуу дарылоо болушу мүмкүн. 2-таблицада CRISPR/Cas9 бардык туруктуулук гендерине багытталганы айтылат.
2-таблица. CRISPR/Cas9 клеткаларды ракка каршы дары-дармектерге сезгич кылуу үчүн ар кандай TNBC каршылык көрсөтүүчү гендерди бутага алат.
CRISPR/Cas9 китепканалары рактын патогенези менен байланышкан ген мутацияларын скринингдөө үчүн потенциалдуу куралдар болуп саналат (Chan et al., 2022). Бул скрининг ыкмасы (а) китепкананы куруу, (б) лентивирустук трансдукция, (в) фенотиптик скрининг жана (г) максаттуу генди талдоо сыяктуу төрт кадамды камтыйт. TNBCде MAPK жолунун анормалдуу активдешүүсү болгону менен, PTEN, RB1 жана TP53 сыяктуу шишикти басуучу гендерде мутацияларды алып жүрүүчү TNBC бейтаптары үчүн MEK максаттуу терапиясынын клиникалык прогнозу өтө начар.
Мындан тышкары, CRISPR/Cas9 колдонулган гендик нокаут скрининги дегидрокатролдун MDA-MB-231ге тийгизген таасирин түшүнүү үчүн Гватемала гүлдөрүнүн жана жалбырактарынын экстракттарында көп кездешкен эң күчтүү жана тандалма молекула дегидрокатролду сынаган. Тандалма клетка цитотоксикалуулугунун механизмдери. TNBC субтиптеринин мезенхималык сабагынын мүнөздөмөлөрү. Бул CRISPR/Cas9 негизиндеги скрининг ошондой эле 17β-гидроксистероиддик дегидрогеназанын 11-тибин коддогон ген HSD17B11 MDA-MB-231 клеткаларында жогорку деңгээлде экспрессияланаарын жана MDA-MB-231 клеткаларына мүнөздүү дегидрофалькаринолду пайда кылаарын көрсөттү (Grant et al., 2020). Ошентип, бул CRISPR/Cas9 геномдук скринингинин потенциалдуу табигый кошулмалардын ракка каршы касиеттеринин негизиндеги механизмдерди аныктоодо чоң потенциалга ээ экенин көрсөтүп турат.
Мындан тышкары, TNBCнин ракка болгон алсыздыгы геном боюнча in vivo CRISPR/Cas9 скринингин колдонуу менен изилденген, ал онкогендик жана шишикти басуучу жолдордун ортосундагы байланышты көрсөткөн. mTOR жана Hippo жолдорунун негизги компоненттери TNBCде шишикти жөнгө салууда маанилүү ролду ойной тургандыгы кабарланган. Мындан тышкары, изилдөөлөр mTORC1/2 жана YAP онкопротеинин фармакологиялык ингибирлөө in vitro дары-матрица синергия моделин жана in vivo пациенттен алынган ксенотрансплантаттарды колдонуу менен TNBCнин патогендүүлүгүн натыйжалуу ингибирлей тургандыгын көрсөттү. Андан тышкары, Торин-1 аркылуу mTORC1/2 ингибирлөө макропиноцитозду күчөтөт, ал эми вертепорфин менен индукцияланган YAP ингибирлөөсү TNBC клеткаларынын өлүмүнө алып келет. Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар TNBC үчүн жаңы жана натыйжалуу дарылоо ыкмаларын аныктоо үчүн геном боюнча in vivo CRISPR скринингинин күчүн жана бекемдигин баса белгилейт (Dai et al., 2021).
Иммундук системанын бузулушу шишиктин пайда болушунун маанилүү фактору болуп саналат. Рак клеткалары коргонуу механизмдерин айланып өтүп, анын ичинде шишиктин микрочөйрөсүндөгү иммундук клеткалардын активдүүлүгүнө кийлигишип, иммундук системаны бузуп, иммундук тазалоодон качышат. Ошондуктан, жакшыртылган иммундук системаны иштеп чыгуу шишиктер менен күрөшүүнүн негизги ыкмасы болушу мүмкүн. CRISPR/Cas9 негизиндеги ген модификациясын колдонуу иммундук дисфункцияга байланыштуу бир нече маселелерди ар кандай көз караштардан чечет. CRISPR/Cas9 эмчек рагына каршы шишикке каршы иммунитетти төмөнкү жолдор аркылуу жакшыртуу үчүн колдонулган (3-сүрөт).
3-сүрөт. CRISPR/Cas9 иммунотерапиясы TNBC клеткаларына багытталган. CDK5тин жоголушу жана PDL1 менен CD155тин нокдауну иммундук системаны чыңдайт. Ошо сыяктуу эле, A2ARдын жоголушу жана HER2, муцин 1 жана TEM8 сыяктуу TAAлардын нокдауну CAR-T клеткаларынын рак клеткаларын жок кылуудагы натыйжалуулугун жогорулатты. CRISPR/Cas9 менен башкарылган Т клеткаларын скрининг жүргүзүү p38 киназанын бузулушу Т клеткаларынын шишикке каршы активдүүлүгүн күчөтөрүн көрсөттү. CRISPR/Cas9 тарабынан модификацияланган Т клеткалары TCR (Т клетка рецептору) экспрессиясын жогорулатат, натыйжада Т клеткалары шишикке каршы активдүүлүккө ээ болот.
Иммунотерапиянын максаты - иммундук системаны рак клеткаларына чабуул коюуга стимулдаштыруу. Иммундук текшерүү пунктунун белокторунун ашыкча экспрессиясы, адатта, аутоиммундук реакциялардын алдын алат, бирок рактын алдын алууга жардам берет (Топалиан жана башкалар, 2015). Бул белоктор иммундук клеткалардын бетиндеги рецепторлорго байланышуу менен иммундук реакциялардын алдын алат. Бир нече текшерүү пунктунун белоктору (мисалы, CD155 жана PD-L1) иммундук клеткалардагы PD-1 рецепторун бутага алат жана эмчек рагында, айрыкча TNBCде экспрессияланат (Li Y.-C. жана башкалар, 2020). CRISPR/Cas9 колдонуп PD-L1ди же анын рецепторун нокаунд кылуу иммундук системаны TNBC шишиктерине чабуул коюуга стимулдай алат (Yahata жана башкалар, 2019). Мындан тышкары, CRISPR/Cas9 аркылуу CDK5ти жок кылуу аркылуу PD-L1 экспрессиясын төмөндөтүү in vitro жана in vivo шишиктин өсүшүн басаңдатаары көрсөтүлгөн (Денг жана башкалар, 2020). Эмчек рагынын in vitro жана in vivo моделдериндеги өсүштү басаңдатуу CD155тин shRNA аркылуу азайышы эмчек рагына терапиялык таасир этиши мүмкүн экенин көрсөтүп турат (Gao et al., 2018).
CAR Т клеткалары шишик менен байланышкан антигендерди (TAA) тааныган жана алардын активдүүлүгүн жогорулатуу үчүн текшерүүчү белокторду нокдаун кыла алган CARларды экспрессиялайт (Li C. et al., 2020). Эмчек рагында CAR Т клеткаларын дарылоо үчүн ар кандай потенциалдуу максаттар бар, анын ичинде HER2, mucin1 жана TEM8 сыяктуу бир нече TAAлар бар (Bajgain et al., 2018). Мезотелинди (TNBC BT-459 клеткаларында ашыкча экспрессияланган) бутага алган CAR Т клеткалары PD-1 CRISPR/Cas9 аркылуу нокдаунга учураганда ракка каршы натыйжалуураак экендиги жөнүндө далилдер бар (Hu et al., 2019). Бирок, бейтаптардан Т клеткаларын бөлүп алып, андан кийин аларды ex vivo түрдө редакциялоо эмгекти жана убакытты талап кылган процесс. Универсалдуу Т клеткалары изоляция талаптарын азайта алса да, адамдын лейкоцит антигенин (HLA) I класстагы жана Т клетка рецепторун (TCR) экспрессиялаган донор Т клеткалары трансплантаттын кожоюнга каршы аномалияларынын алдын алуу үчүн алынып салынышы керек (Ren et al., 2017). , 2017a). CRISPR/Cas9 колдонуу менен HDR бир эле учурда TCR жана HLAны жок кылып, CARды коддогон генди жок кыла алат. Изилдөөлөр көрсөткөндөй, CRISPR/Cas9 TCR локусуна анти-CD19 CARларды киргизүү үчүн колдонулушу мүмкүн, ошону менен Т-клеткаларды жок кылбастан CARларды натыйжалуу өндүрөт (Dimitri et al., 2022). TCR, бета-2-микроглобулинди (B2M), HLA-I суббирдигин жана PD-1 жана CTLA-4 сыяктуу башка белокторду бир эле учурда жок кылуу менен аллогендик CAR T клеткаларын түзүү үчүн мультиплекс технологиялар иштелип чыккан, алар TNBCге каршы ракка каршы касиетке ээ болушу мүмкүн (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
CRISPR/Cas9 колдонуу CAR-T клеткаларынын натыйжалуулугун жогорулатышы мүмкүн. Аденозин иммуносупрессивдүү касиетке ээ экени белгилүү жана Т-клетка функциясын бөгөттөө жана аденозин A2A рецепторлорун (A2AR) активдештирүү менен ракка каршы иммунитетти төмөндөтө алат (Vigano et al., 2019). CRISPR/Cas9 колдонуу менен A2ARды үнсүз кылуу in vivo CAR-T клеткаларынын натыйжалуулугун бир топ жакшыртты (Giuffrida et al., 2021). Т-клеткалар клеткалык кеңейүү, дифференциация, кычкылдануу стресси жана геномдук стресс сыяктуу ар кандай фенотиптик мүнөздөмөлөрдү көрсөтөөрү белгилүү. CRISPR/Cas9 негизиндеги Т-клеткаларды скринингдөө 25 ар кандай Т-клетка рецептордук киназанын бузулушун көрсөттү. Алардын арасында p38 киназанын делециясы Т-клеткалардын шишикке каршы активдүүлүгүн күчөтөрү көрсөтүлдү, бул p38 киназанын CAR-T клеткасынын жөнгө салынышынын негизги жөнгө салуучусу экенин көрсөтүп турат (Gurusamy et al., 2020).
Т-клеткаларды CRISPR/Cas9 аркылуу генетикалык жактан модификациялап, жогорку экспрессияланган TCRлерди өндүрүүгө болот. Генетикалык жактан модификацияланган Т-клеткаларды бейтаптарга өткөрүп берүү эндогендик Т-клеткаларга караганда ракка каршы күчтүү активдүүлүктү көрсөттү. Ошондуктан, эндогендик TCRлер бейтаптарда генетикалык жактан өзгөртүлгөн TCRлер менен атаандаша алат, бул рак иммунотерапиясынын потенциалына таасир этиши мүмкүн. Бул көйгөйдү чечүү үчүн, реципиент клеткаларындагы эндогендик TCR-βны алып салуу жана андан кийин TCR-β Т-клеткаларын рак менен ооруган бейтаптарга өткөрүп берүү үчүн CRISPR/Cas9 колдонуу эндогендик TCR жыныстык атаандаштыгынын кереги жок эле ракка каршы иммундук жоопторду жакшыраак көрсөтүшү мүмкүн (Fan et al. 2018). Ошентип, CRISPR менен модификацияланган Т-клеткалардан тышкары, TCRлер кадимки TCR менен трансдукцияланган Т-клеткаларга караганда шишик антигендерине миң эсе сезгич. Мындан тышкары, ар кандай лейкоздордо γδ TCR+ CRISPR тарабынан түзүлгөн өзгөртүлгөн Т-клеткалар стандарттуу TCR өткөрүп берүүгө караганда CD4+ жана CD8+ Т-клеткаларынын жогорку экспрессиясын көрсөтөт (Legut et al., 2018). Ошентип, CRISPR/Cas9 тарабынан түзүлгөн модификацияланган Т-клеткалар TNBCни жеңүү үчүн натыйжалуу иммунотерапия ыкмасы болушу мүмкүн.
Интегриндер – бул клеткалык трансмембраналардагы клеткалардын адгезия молекулалары жана клеткалардын клеткадан тышкаркы матрицага (ECM) байланышын күчөтөт (Hamidi жана Ivaska, 2018). Интегриндердин жөнгө салынышынын бузулушу клеткадан тышкаркы матрицаны өзгөртүү менен рактын өнүгүшү жана миграциясы менен байланыштуу, бул кан айлануудагы рак клеткаларынын жашоосуна алып келет (Hamidi жана Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9 аркылуу интегриндин нокдауну TNBCде шишиктин өрчүшүн, метастаздарды жана колонизацияны жайлатат. Интегрин a5тин (ITGA5) нокдауну өпкө рагы сыяктуу башка рак ооруларында клеткалардын миграциясын жана өрчүшүн азайтаары кабарланган (Ju et al., 2017), бул интегрин a5тин да TNBCнин патогенезинде негизги фактор болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Салттуу эмбриондук өзөк клеткаларынын (ES) ыкмаларын колдонуу менен нокаут чычкандарды алуу көп эмгекти талап кылган, көп убакытты талап кылган жана натыйжасыз процесс. Гомологиялык рекомбинация аркылуу ES клеткаларын бутага алуу, химердик чычкандарды көбөйтүү жана андан кийин аларды гетерозиготалуу чычкандар менен аргындаштыруу гомозиготалуу тукумдарды алуу үчүн бир нече ай жана жылдарды талап кылат. Бир нече генетикалык мутациялары бар чычкандарды түзүү үчүн татаал аргындаштыруу талап кылынат. Бирок, CRISPR/Cas9 колдонуу менен ES клеткаларын абляциялоо же CRISPR/Cas9 компоненттерин бир клеткалуу уруктандырылган жумурткаларга микроинъекциялоо жолу менен пайда болгон чычкандарды колдонууда көптөгөн көйгөйлөр пайда болду. Мисалы, өзгөрүүлөр көбүнчө биаллелдик локустарда болот жана генге мүнөздүү эмес. Жакында эле CRISPR/Cas9 технологиясын колдонгон ES клеткалары бир эле учурда 5 генге чейин биаллелдик мутацияларды киргизе алары кабарланган (Нишизоно жана башкалар, 2021). Бул максатта Cas9 мРНКсы жана беш генге мүнөздүү гРНК бир эле учурда ES клеткаларына трансфекцияланган. Бул процедуранын келечегин жана натыйжалуулугун баса белгилейт, бирок бул мутациялар негиздөөчү линиялар беш нокаут чычкандарды өндүрүү үчүн өстүрүлгөндө берилиши мүмкүн. Изилдөө ошондой эле күтүлбөгөн ачылышты билдирет: генетикалык жактан модификацияланган чычкандарды түзүү үчүн ES клеткалары мындан ары талап кылынбайт. Анын ордуна, белгилүү бир ген продуктуларын алып салуу үчүн Cas9 мРНКсы жана гРНКсы бир клеткалуу стадиядагы эмбриондорго сайылган. Натыйжада, теориялык жактан чычкандардагы гендердин жок кылынышынын кесепеттерин изилдөө үчүн колдонула турган нокаут негиздөөчү линиялары түзүлгөн (Qin et al., 2016). Ошентип, CRISPR/Cas9 салттуу генетикалык инженерияга караганда арзаныраак баада TNBC дарылоо үчүн трансгендик чычкандарды түзүүгө мүмкүндүк берет. CRISPR/Cas системасын колдонуу менен TNBCдеги бир же бир нече эндогендик гендерге чекиттик мутацияларды ийгиликтүү киргизе турган жаңы нокаут чычкан модели иштелип чыккан. Бул концепциянын негизинде, TNBCнин жаныбарлардагы моделдерин CRISPR/Cas9 аркылуу BRCA1 жана p53тү жок кылуу аркылуу да иштеп чыгууга болот, бул HR калыбына келтирүүнүн жоголушуна, геномдук туруксуздукка жана мутанттык фенотиптерге алып келет (Annunziato et al., 2020).
Учурда маммография, магниттик-резонанстык томография (МРТ) жана УЗИ сыяктуу ар кандай ыкмалар эмчектин рак клеткаларын аныктоо үчүн колдонулат. Бирок, бул ыкмалардын айрым чектөөлөрү бар. Маммография рак клеткалары башка органдарга көчүп кеткен метастаздарды эмес, жергиликтүү эмчек ткандарын аныктоо үчүн колдонулат. УЗИ - эмчектин рак клеткаларын аныктоонун ишенимдүү ыкмасы эмес (Chen and Lee-Felker, 2023). МРТ УЗИге жана маммографияга караганда жогорку сезгичтикке ээ, бирок анын диагностикалык тактыгы чектелүү (Sha and Chen, 2022). Ткан биопсиясы - рак клеткаларын аныктоонун инвазивдүү жолу. Бирок, кээ бир учурларда, эгерде ийне кызыккан аймактан чыгып кетсе, биопсия рак ткандарын өткөрүп жибериши мүмкүн. Мындан тышкары, ал абдан кымбат жана бейтап үчүн травматикалык болушу мүмкүн. Эмчектин рак клеткаларын аныктоо гетерогендик рактын түрү, андыктан биопсия рактын түрү жөнүндө жетиштүү маалымат бербеши мүмкүн. Ошондуктан, эмчектин рак клеткаларын аныктоонун жаңы диагностикалык жактан ишенимдүү ыкмасы шашылыш түрдө зарыл. CRISPR/Cas9 эмчек рагын аныктоо үчүн өтө сезгич жана минималдуу инвазивдүү альтернатива катары кызмат кылышы мүмкүн. Ушул максатта, CRISPR/Cas9 негизиндеги стратегиялар TNBC диагнозун коюу үчүн ПЦР ыкмаларын жакшыртуу үчүн колдонулушу мүмкүн. Алгач, CRISPR системасынын Cas9 жана cpf1 белоктору спецификалык эмес ДНКны алып салуу үчүн колдонулат, андан кийин бул эки белок (Cas9 жана cpf1) максаттуу ДНКга байланганга чейин PAM ырааттуулугун тааный алат (Дипак Сингх жана башкалар, 2021). Ошентип, ПЦР рактын өнүгүшү менен байланышкан мутацияларды аныктай алат. Бир нече изилдөөлөр ар кандай рак ооруларындагы ар кандай мутацияларды аныктоо үчүн CRISPR негизиндеги бул стратегияны кабыл алышкан (Safari жана башкалар, 2019). Ошентип, CRISPR негизиндеги ПЦР ыкмалары TNBC диагнозунун биопсияга негизделген иммуногистохимия сыяктуу инвазивдик ыкмаларга көз карандылыгын азайтышы мүмкүн.
Гормон рецепторлорун жөнгө салуудагы генотиптик өзгөрүүлөр TNBCде да көрсөтүлгөн (Chen and Russo, 2009). Дарыгерге кайрылуу учурундагы диагностика үчүн микрочиптерди колдонгон CRISPR/Cas9 негизиндеги ПЦР стратегиялары бул мутацияларды натыйжалуу көзөмөлдөй алат (Hajian et al., 2019). Ошондой эле, ал саламаттыкты сактоо кызматкерлерине TNBC бейтаптарындагы белгилүү бир мутациялар жөнүндө тиешелүү маалымат бере алат, бул алардын дарылоо курсун жакшыртууга жардам берет. Бирок, бул айкалышкан ыкманын чектөөлөрү бар. Ошондуктан, бул CRISPR/Cas-PCR ыкмасын TNBC диагнозу үчүн саламаттыкты сактоодо колдонуудан мурун кеңири изилдөө иштери талап кылынат (Yang et al., 2019).
Жарыяланган убактысы: 2024-жылдын 14-октябры