Компьютердик томография (КТ) менен аныкталган өпкө түйүндөрүнүн дифференциалдык диагностикасы клиникалык практикада көйгөй бойдон калууда.Бул жерде биз 480 сыворотка үлгүлөрүнүн глобалдык метаболомун мүнөздөйбүз, анын ичинде дени сак контроль, жакшы өпкө түйүндөрү жана I стадиядагы өпкө аденокарциномасы.Аденокарциномалар уникалдуу метаболомикалык профилдерди көрсөтүшөт, ал эми залалсыз түйүндөр менен дени сак адамдар метаболомикалык профилдердин окшоштугуна ээ.Ачылыш тобунда (n = 306) 27 метаболиттердин топтому зыянсыз жана зыяндуу түйүндөрдү айырмалоо үчүн аныкталган.Ички валидация (n = 104) жана тышкы валидация (n = 111) топторундагы дискриминант моделинин AUC тиешелүүлүгүнө жараша 0,915 жана 0,945 болгон.Жолдун анализи өпкөнүн аденокарциномасынын сывороткасында триптофандын азайышы менен байланышкан көбөйгөн гликолитикалык метаболиттерди, зыянсыз түйүндөр жана дени сак башкаруу органдары менен салыштырып көрсөттү жана триптофанды кабыл алуу өпкө рагы клеткаларында гликолизге өбөлгө түзөт деп сунуштады.Биздин изилдөөбүз КТ тарабынан аныкталган өпкө түйүндөрүнүн коркунучун баалоодо кан сары суунун метаболитинин биомаркерлеринин маанисин баса белгилейт.
Эрте диагностика рак менен ооругандардын жашоо көрсөткүчтөрүн жакшыртуу үчүн абдан маанилүү болуп саналат.АКШнын Улуттук өпкө рагын скринингдик сынагынын (NLST) жана европалык NELSON изилдөөсүнүн натыйжалары төмөн дозалуу компьютердик томография (LDCT) менен скрининг жүргүзүү коркунучу жогору болгон топтордо өпкө рагына чалдыккан өлүмдөрдү олуттуу түрдө азайта аларын көрсөттү1,2,3.өпкө рагы скрининг үчүн LDCT жайылган колдонуудан бери, симптомсуз өпкө түйүндөрүнүн кокустан рентгенографиялык табылгалары 4 жогорулатууну улантты.Өпкө түйүндөрү диаметри 5 3 см ге чейин очоктук тунук эмес деп аныкталат.Биз залалдуу оорунун ыктымалдыгын баалоодо жана LDCT боюнча кокустан табылган өпкө түйүндөрүнүн көп саны менен күрөшүүдө кыйынчылыктарга туш болобуз.КТ чектөөлөр тез-тез кийинки текшерүүлөрдү жана жалган-оң натыйжаларды алып келиши мүмкүн, керексиз кийлигишүү жана ашыкча дарылоо6.Ошондуктан, алгачкы этапта өпкө рагын туура аныктоо үчүн ишенимдүү жана пайдалуу биомаркерлерди иштеп чыгуу жана алгачкы аныктоодо 7 көпчүлүк зыянсыз түйүндөрүн айырмалоо зарылчылыгы бар.
Геномика, протеомика же ДНК methylation8,9,10, анын ичинде кандын комплекстүү молекулярдык анализи (сары, плазма, перифериялык кан мононуклеардык клеткалары), өпкө рагы үчүн диагностикалык биомаркерлердин ачылышына кызыгуунун өсүшүнө алып келди.Ошол эле учурда, метаболомикалык ыкмалар эндогендик жана экзогендик аракеттердин таасири астында болгон клеткалык акыркы продуктуларды өлчөйт, ошондуктан оорунун башталышын жана натыйжасын алдын ала айтуу үчүн колдонулат.Суюк хроматография-тандемдик масс-спектрометрия (LC-MS) жогорку сезгичтиги жана ар кандай физикалык-химиялык касиеттери бар метаболиттерди камтый турган чоң динамикалык диапазондун аркасында метаболомиканы изилдөө үчүн кеңири колдонулган ыкма болуп саналат11,12,13.Плазма / сыворотка глобалдык метаболомикалык талдоо өпкө рагы диагностикасы14,15,16,17 жана дарылоонун натыйжалуулугу менен байланышкан биомаркерлерди аныктоо үчүн колдонулса да, өпкөнүн залалдуу жана залалдуу түйүндөрүн айырмалоо үчүн 18 сыворотка метаболитинин классификаторлору дагы деле көп изилденип келет.- массалык изилдөө.
Аденокарцинома жана сквама клеткалуу карцинома майда эмес клетка өпкө рагынын эки негизги түрү болуп саналат (NSCLC).Ар кандай КТ скрининг тесттери аденокарцинома өпкө рагы1,19,20,21 таралган гистологиялык түрү экенин көрсөтүп турат.Бул изилдөөдө биз 695 сыворотканын үлгүлөрүнө метаболомика анализин жүргүзүү үчүн ультра натыйжалуу суюктук хроматография-жогорку чечим масс-спектрометриясын (UPLC-HRMS) колдондук, анын ичинде дени сак контроль, жакшы өпкө түйүндөрү жана CT тарабынан аныкталган ≤3 см.I стадиядагы өпкө аденокарциномасына скрининг.Биз өпкө аденокарциномасын залалсыз түйүндөрдөн жана дени сак контролдоочулардан айырмалаган сывороткадагы метаболиттердин панелин аныктадык.Жолду байытуу анализи анормалдуу триптофан жана глюкоза метаболизми өпкө аденокарциномасында залалдуу түйүндөр жана дени сак башкаруу органдарына салыштырмалуу кеңири таралган өзгөрүү экенин көрсөттү.Акыр-аягы, биз LDCT тарабынан аныкталган залалдуу жана залалсыз өпкө түйүндөрүн айырмалоо үчүн жогорку өзгөчөлүгү жана сезгичтиги менен сывороткадагы метаболизм классификаторун түздүк жана тастыктадык, бул эрте дифференциалдык диагностикага жана тобокелдикти баалоого жардам берет.
Учурдагы изилдөөдө 174 дени сак адамдан, өпкө түйүндөрүнүн залалсыздыгы бар 292 пациенттен жана I стадиядагы өпкө аденокарциномасы бар 229 бейтаптан жынысы жана жашы боюнча дал келген сыворотка үлгүлөрү ретроспективдүү түрдө чогултулган.695 субъекттин демографиялык мүнөздөмөлөрү 1-таблицада көрсөтүлгөн.
1а-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, Сун Ят-сен университетинин онкология борборунда жалпы 480 сыворотка үлгүлөрү, анын ичинде 174 дени сак контролдоо (HC), 170 жакшы бездер (BN) жана 136 I этаптагы өпкө аденокарциномасы (LA) үлгүлөрү чогултулган.Ультра натыйжалуу суюк хроматография-жогорку чечилиштеги масс-спектрометрия (UPLC-HRMS) аркылуу максатсыз метаболомикалык профилдөө үчүн ачылыш когорт.Кошумча 1-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, LA жана HC, LA жана BN ортосундагы дифференциалдык метаболиттер классификация моделин түзүү жана дифференциалдык жол анализин изилдөө үчүн аныкталган.Сун Ят-сен университетинин онкология борбору тарабынан чогултулган 104 үлгү жана башка эки оорукана тарабынан чогултулган 111 үлгү тиешелүүлүгүнө жараша ички жана тышкы валидациядан өткөн.
Ультра эффективдүү суюк хроматография-жогорку чечмелөөдөгү масс-спектрометрия (UPLC-HRMS) аркылуу глобалдык сывороткадагы метаболомика анализинен өткөн ачылыш когортундагы изилдөө калкы.b Изилдөө тобунан 480 сыворотка үлгүлөрүнүн жалпы метаболомунун жарым-жартылай эң аз квадраттык дискриминанттык анализи (PLS-DA), анын ичинде дени сак контролдоочулар (HC, n = 174), зыянсыз түйүндөр (BN, n = 170) жана I стадиядагы өпкө аденокарциномасы (Лос-Анджелес, n = 136).+ESI, оң электроспрей иондоштуруу режими, -ESI, терс электроспрей иондоштуруу режими.c–e Берилген эки топто бир кыйла айырмаланган метаболиттер (эки куйруктуу Вилкоксон кол коюлган ранг сынагы, жалган ачуу ылдамдыгы туураланган p мааниси, FDR <0,05) кызыл (бүктөлгөн өзгөртүү > 1,2) жана көк (бүктөлгөн өзгөрүү < 0,83) менен көрсөтүлгөн. .) вулкандын графикасында көрсөтүлгөн.f Иерархиялык кластердик жылуулук картасы LA жана BN ортосундагы аннотацияланган метаболиттердин санында олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүү.Булак маалыматтар баштапкы маалымат файлдары түрүндө берилет.
Ачылыш тобунда 174 HC, 170 BN жана 136 LA жалпы сывороткасы метаболому UPLC-HRMS анализин колдонуу менен талданды.Биринчиден, биз сапатты көзөмөлдөө (QC) үлгүлөрү көзөмөлсүз негизги компоненттик анализдин (PCA) моделинин борборунда тыгыз топтошуп, учурдагы изилдөөнүн туруктуулугун ырастайбыз (Кошумча 2-сүрөт).
1 б-сүрөттө жарым-жартылай эң аз квадраттар-дискриминанттык анализде (PLS-DA) көрсөтүлгөндөй, биз оң (+ESI) жана терс (-ESI) электроспрей иондоштуруу режимдеринде LA жана BN, LA жана HC ортосунда так айырмачылыктар бар экенин таптык. .изоляцияланган.Бирок, +ESI жана -ESI шарттарында BN жана HC ортосунда эч кандай олуттуу айырмачылыктар табылган жок.
Биз LA жана HC ортосунда 382 дифференциалдык өзгөчөлүктөрдү, LA жана BN ортосунда 231 дифференциалдык өзгөчөлүктөрдү жана BN менен HC ортосунда 95 дифференциалдык өзгөчөлүктөрдү таптык (Уилкоксон кол коюлган рангдагы тест, FDR <0,05 жана бир нече өзгөртүү >1,2 же <0,83) (Figure .1c-e) )..Чокулары андан ары аннотацияланган (Кошумча маалыматтар 3) маалымат базасына (mzCloud/HMDB/Chemspider китепканасы) каршы м/з мааниси, кармоо убактысы жана фрагментация массасынын спектрин издөө (методдор бөлүмүндө сүрөттөлгөн чоо-жайы) 22.Акыр-аягы, 33 жана 38 аннотацияланган метаболиттер, тиешелүүлүгүнө жараша, BNге каршы LA (1f жана кошумча таблица) жана HCге каршы LA (Кошумча 3 жана Кошумча таблица 2) үчүн аныкталган.Ал эми, BN жана HCде (кошумча таблица 2) молчулукта олуттуу айырмачылыктары бар 3 гана метаболиттер аныкталган, бул PLS-DAдагы BN жана HC ортосундагы дал келүүчү.Бул дифференциалдык метаболиттер биохимиялык заттардын кеңири спектрин камтыйт (Кошумча 4-сүрөт).Чогуу алганда, бул натыйжалар өпкө түйүндөрүнө же дени сак субъекттерге салыштырганда өпкөнүн алгачкы стадиясындагы рактын залалдуу трансформациясын чагылдырган сары суунун метаболомунда олуттуу өзгөрүүлөрдү көрсөтөт.Ошол эле учурда, BN жана HC сывороткасынын метаболомунун окшоштугу жакшы өпкө түйүндөрүнүн дени сак адамдар менен көптөгөн биологиялык өзгөчөлүктөргө ээ болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.Эпидермалдык өсүү факторунун рецепторунун (EGFR) ген мутациялары өпкө аденокарциномасынын 23-түрчөсүндө кеңири таралганын эске алуу менен, биз айдоочу мутациялардын кан сары суусунун метаболомуна тийгизген таасирин аныктоого аракет кылдык.Андан кийин биз өпкө аденокарциномасы тобунда EGFR статусу бар 72 иштердин жалпы метаболомикалык профилин талдадык.Кызыктуусу, биз PCA анализинде EGFR мутант пациенттери (n = 41) менен EGFR жапайы типтеги пациенттердин (n = 31) ортосунда салыштырылуучу профилдерди таптык (Кошумча сүрөт 5a).Бирок, биз жапайы типтеги EGFR менен ооруган бейтаптарга салыштырмалуу EGFR мутациясы менен ооруган бейтаптарда 7 метаболиттерди аныктадык (t тест, p <0,05 жана бүктөлгөн өзгөртүү> 1,2 же <0,83) (Кошумча сүрөт 5b).Бул метаболиттердин көпчүлүгү (7ден 5) май кислоталарынын кычкылдануу жолдорунда маанилүү ролду ойногон ацилкарнитиндер.
2 а-сүрөттө көрсөтүлгөн иш процессинде көрсөтүлгөндөй, түйүндөрдүн классификациясы үчүн биомаркерлер эң аз абсолюттук кичирейүү операторлорун жана LA (n = 136) жана BN (n = 170) аныкталган 33 дифференциалдык метаболиттердин негизинде тандоону колдонуу менен алынган.Өзгөрмөлөрдүн эң жакшы айкалышы (LASSO) – экилик логистикалык регрессия модели.Моделдин ишенимдүүлүгүн текшерүү үчүн он эселенген кайчылаш валидация колдонулган.Өзгөрмөлөрдү тандоо жана параметрди регуляризациялоо λ24 параметри менен ыктымалдыкты максималдаштыруу жазасы менен жөнгө салынат.Глобалдык метаболомика анализи андан ары ички валидацияда (n = 104) жана тышкы валидацияда (n = 111) дискриминанттык моделдин классификациясынын иштешин текшерүү үчүн өз алдынча жүргүзүлдү.Натыйжада, ачылыш топтомундагы 27 метаболиттер эң чоң орточо AUC мааниси менен эң мыкты дискриминант модели катары аныкталган (сүрөт 2б), алардын арасында 9 активдүүлүктү жогорулаткан жана LAдагы активдүүлүктү 18 төмөндөткөн BN (сүрөт. 2c).
Өпкө түйүнүнүн классификаторун түзүү боюнча иш процесси, анын ичинде он эселенген кайчылаш валидация аркылуу бинардык логистикалык регрессия моделин колдонуу менен ачылыш топтомундагы сывороткадагы метаболиттердин эң жакшы панелин тандоо жана ички жана тышкы валидация топтомдорундагы прогноздук натыйжалуулукту баалоо.б Метаболикалык биомаркер тандоо үчүн LASSO регрессия моделинин кайчылаш текшерүү статистикасы.Жогоруда берилген сандар берилген λда тандалган биомаркерлердин орточо санын билдирет.Кызыл чекит сызык тиешелүү ламбдадагы орточо AUC маанисин билдирет.Боз ката тилкелери минималдуу жана максималдуу AUC маанилерин билдирет.чекиттүү сызык 27 тандалган биомаркер менен мыкты моделин көрсөтөт.AUC, кабылдагычтын иштөө мүнөздөмөсү (ROC) ийри сызыгынын астындагы аймак.c Ачылыш тобундагы BN тобуна салыштырмалуу LA тобунда тандалган 27 метаболиттердин бүктөлгөн өзгөрүүлөрү.Кызыл тилке – активдештирүү.Көк мамыча - төмөндөө.d–f Ачылыш, ички жана тышкы валидация топтомдорундагы 27 метаболиттик айкалыштырууга негизделген дискриминанттык моделдин күчүн көрсөткөн кабылдагычтын иштөө мүнөздөмөсү (ROC) ийри сызыктары.Булак маалыматтар баштапкы маалымат файлдары түрүндө берилет.
Бул 27 метаболиттин салмактуу регрессия коэффициенттеринин негизинде болжолдоо модели түзүлгөн (Кошумча таблица 3).Бул 27 метаболиттерге негизделген ROC талдоо ийри сызык астындагы аймакты (AUC) 0,933 маанисин берди, ачылыш тобунун сезгичтиги 0,868, өзгөчөлүгү 0,859 (сүрөт 2d).Ошол эле учурда, LA жана HC ортосундагы 38 аннотацияланган дифференциалдык метаболиттердин арасында, 16 метаболиттердин жыйындысы LAны HCден айырмалоодо 0,801 сезгичтиги жана 0,856 өзгөчөлүгү менен AUC 0,902ге жеткен (Кошумча сүрөт 6a-c).Дифференциалдык метаболиттер үчүн ар кандай бүктөлүү босогосуна негизделген AUC маанилери да салыштырылган.Биз классификациялоо модели LA жана BN (HC) ортосунда дискриминациялоодо эң жакшы аткарганын таптык, качан бүктөлгөн өзгөрүү деңгээли 1,2ге каршы 1,5 же 2,0 (кошумча 7a, b).27 метаболиттик топтордун негизинде классификация модели, андан ары ички жана тышкы когорталарда тастыкталган.AUC ички валидация үчүн 0,915 (сезгичтик 0,867, өзгөчөлүк 0,811) жана тышкы валидация үчүн 0,945 (сезгичтик 0,810, өзгөчөлүк 0,979) болгон (сүрөт 2e, f).Лабораториялар аралык эффективдүүлүктү баалоо үчүн, Методдор бөлүмүндө сүрөттөлгөндөй тышкы когорттан алынган 40 үлгү тышкы лабораторияда талданды.Классификациянын тактыгы AUC 0,925ке жетти (Кошумча 8-сүрөт).Өпкөнүн жалпак клеткалуу карциномасы (LUSC) өпкө аденокарциномасынан (LUAD) кийин кичинекей эмес клеткалуу өпкө рагынын (NSCLC) эң көп таралган экинчи түрү болгондуктан, биз метаболикалык профилдердин тастыкталган потенциалдуу пайдалуулугун да сынап көрдүк.BN жана 16 LUSC учурлары.LUSC жана BN ортосундагы басмырлоонун AUC 0.776 (Кошумча 9-сүрөт) болгон, бул LUAD жана BN ортосундагы дискриминацияга салыштырмалуу начарраак жөндөмүн көрсөтүп турат.
Изилдөөлөр көрсөткөндөй, КТ сүрөттөрү боюнча түйүндөрдүн өлчөмү зыяндуу болуу ыктымалдыгы менен оң байланышта жана түйүндөрдү дарылоонун негизги аныктоочусу бойдон калууда.NELSON скрининг изилдөөнүн чоң когортасынан алынган маалыматтарды талдоо бездери <5 мм менен субъекттерде зыяндуу коркунучу, ал тургай, бездери 28 жок субъекттерде окшош экенин көрсөттү.Ошондуктан, үзгүлтүксүз КТ мониторинг талап минималдуу өлчөмү 5 мм, Британ көкүрөк коому (BTS) тарабынан сунушталган, жана Fleischner коому 29 тарабынан сунушталган 6 мм болуп саналат.Бирок, 6 ммден ашкан түйүндөр жана айкын жакшы сапаттары жок, аныкталбаган өпкө түйүндөрү (IPN) деп аталган клиникалык практикада баалоодо жана башкарууда негизги көйгөй бойдон калууда30,31.Андан кийин биз түйүндөрдүн өлчөмү метаболомикалык кол тамгаларга таасир эткендигин изилдеп көрдүк.27 тастыкталган биомаркерлерге көңүл буруп, биз алгач HC жана BN суб-6 мм метаболомдорунун PCA профилдерин салыштырдык.Биз HC жана BN үчүн маалымат чекиттеринин көбү бири-бирине дал келип, сывороткадагы метаболиттин деңгээли эки топто тең окшош экенин көрсөттү (сүрөт 3a).Ар кандай өлчөмдөгү диапазондогу өзгөчөлүк карталары BN жана LA (сүрөт 3b, в) сакталып калган, ал эми 6-20 мм диапазонунда зыяндуу жана зыянсыз түйүндөрдүн ортосунда бөлүнүү байкалган (сүрөт 3d).Бул когорттун AUC 0,927, спецификасы 0,868 жана 6дан 20 ммге чейинки түйүндөрдүн залалдуулугун алдын ала айтуу үчүн 0,820 сезгичтиги болгон (сүрөт 3e, f).Биздин натыйжалар классификатор түйүндөрдүн өлчөмүнө карабастан, эрте залалдуу трансформациядан келип чыккан метаболизмдик өзгөрүүлөрдү кармай аларын көрсөтүп турат.
жарнама 27 метаболиттердин метаболикалык классификаторунун негизинде көрсөтүлгөн топтордун ортосундагы PCA профилдерин салыштыруу.CC жана BN < 6 мм.b BN < 6 мм vs BN 6–20 мм.ЛАда 6–20 мм, ЛАда 20–30 мм.g BN 6–20 мм жана LA 6–20 мм.GC, n = 174;BN <6 мм, n = 153;BN 6–20 мм, n = 91;LA 6–20 мм, n = 89;LA 20–30 мм, n = 77. 6–20 мм түйүндөр үчүн дискриминанттык моделдин иштешин көрсөткөн кабылдагычтын иштөө мүнөздөмөсү (ROC) ийри сызыгы.f Ыктымалдуулуктун маанилери 6–20 мм өлчөмдүү түйүндөр үчүн логистикалык регрессия моделинин негизинде эсептелген.Боз чекиттүү сызык оптималдуу кесүү маанисин билдирет (0,455).Жогорудагы сандар Лос-Анжелеске болжолдонгон иштердин пайызын билдирет.Эки тараптуу Студенттин t тестин колдонуңуз.PCA, негизги компоненттик анализ.ийри сызык астындагы AUC аянты.Булак маалыматтар баштапкы маалымат файлдары түрүндө берилет.
Окшош өпкө түйүндөрүнүн өлчөмдөрү (7-9 мм) менен төрт үлгүлөр (44-61 жаштагы) мындан ары сунушталган зыяндуу болжолдоо моделинин аткарууну көрсөтүү үчүн тандалган (сүрөт. 4a, б).Алгачкы скринингде 1-жагдай кальцификациясы бар катуу түйүн катары көрсөтүлдү, бул жакшылыкка байланыштуу өзгөчөлүк, ал эми 2-жагдайда эч кандай ачык-айкын зыянсыз белгилери жок, аныкталбаган жарым-жартылай катуу түйүн катары көрсөтүлдү.Үч раунддан кийинки КТ бул учурлар 4 жыл бою туруктуу бойдон калганын жана ошондуктан зыянсыз түйүндөр деп эсептелгенин көрсөттү (сүрөт 4a).Сериялык КТ сканерлөөнүн клиникалык баалоосу менен салыштырганда, учурдагы классификатор модели менен бир жолудан жасалган сыворотка метаболитинин анализи ыктымалдык чектөөлөрдүн негизинде бул зыянсыз түйүндөрдү тез жана туура аныктады (1-таблица).3-жагдайдагы 4б-сүрөттө плевранын тартылуу белгилери бар түйүн көрсөтүлөт, ал көбүнчө залалдуулук32 менен коштолот.4-жагдайы аныкталбаган жарым-жартылай катуу түйүн катары келтирилген, эч кандай зыяндуу себеби жок.Бардык бул учурлар классификатордун моделине ылайык зыяндуу деп болжолдонгон (таблица 1).өпкө adenocarcinoma баа өпкө резекциясы хирургия (сүрөт. 4b) кийин гистопатологиялык изилдөө менен көрсөтүлгөн.Тышкы валидация топтому үчүн метаболикалык классификатор 6 ммден чоңураак өпкө түйүндөрүнүн эки учурун так алдын ала айткан (Кошумча 10-сүрөт).
Эки учурдун өпкөнүн октук терезесинин КТ сүрөттөрү жакшы түйүндөр.1-жагдайда, 4 жылдан кийин КТ оң астыңкы бөлүгүндө кальцификация менен 7 мм өлчөмдүү туруктуу катуу түйүн көрсөттү.2-жагдайда, 5 жылдан кийин КТ оң жагынын үстүнкү бөлүгүндө диаметри 7 мм болгон туруктуу, жарым-жартылай катуу түйүн аныктады.б Октук терезе КТ өпкө сүрөттөрү жана өпкө резекциясына чейин I этап аденокарциномасынын эки учуруна тиешелүү патологиялык изилдөөлөр.3-жагдайда плевра тартылуы бар оң жак үстүнкү бөлүгүндө диаметри 8 мм түйүн аныкталды.4-жагдайда сол жак үстүнкү бөлүгүндө 9 мм өлчөмдүү жарым-жартылай катуу жер айнек түйүн аныкталган.Гематоксилин жана эозин (H&E) өпкө аденокарциномасынын ацинардык өсүү үлгүсүн көрсөтүүчү резекцияланган өпкө кыртышынын боёгу (шкала бар = 50 мкм).Жебелер КТ сүрөттөрүндө аныкталган түйүндөрдү көрсөтөт.H&E сүрөттөрү патолог тарабынан текшерилген бир нече (>3) микроскопиялык талаалардын репрезентативдик сүрөттөрү.
Чогуу алганда, биздин натыйжалар КТ скринингди баалоодо кыйынчылыктарды туудурушу мүмкүн болгон өпкө түйүндөрүнүн дифференциалдык диагностикасындагы сывороткадагы метаболит биомаркерлеринин потенциалдуу маанисин көрсөтөт.
Текшерилген дифференциалдык метаболит панелинин негизинде биз негизги метаболизмдик өзгөрүүлөрдүн биологиялык байланыштарын аныктоого аракет кылдык.MetaboAnalyst тарабынан KEGG жолун байытуу талдоо эки берилген топтун ортосунда 6 жалпы олуттуу өзгөртүлгөн жолдорун аныктады (LA vs. HC жана LA vs. BN, такталган p ≤ 0.001, эффект> 0.01).Бул өзгөрүүлөр пируват метаболизминде, триптофан метаболизминде, ниацин жана никотинамид метаболизминде, гликолизде, TCA циклинде жана пурин метаболизминде бузулуулар менен мүнөздөлгөн (сүрөт 5а).Андан кийин биз абсолюттук сандык аныктоону колдонуу менен негизги өзгөрүүлөрдү текшерүү үчүн максаттуу метаболомиканы аткардык.Чыныгы метаболит стандарттарын колдонуу менен үч эселенген төрт полюстук масса спектрометриясы (QQQ) менен жалпы метаболиттерди жалпы өзгөртүлгөн жолдордо аныктоо.Метаболомиканы изилдөөнүн максаттуу үлгүсүнүн демографиялык мүнөздөмөлөрү Кошумча таблицага киргизилген 4. Глобалдык метаболомиканын натыйжаларына ылайык, сандык анализ гипоксантин жана ксантин, пируват жана лактат BN жана HCге салыштырмалуу LAда көбөйгөнүн тастыктады (сүр. 5b, c, б <0,05).Бирок, бул метаболиттер эч кандай олуттуу айырмачылыктар BN жана HC ортосунда табылган.
BN жана HC топторуна салыштырмалуу LA тобунда бир кыйла ар түрдүү метаболиттерди KEGG жолу байытуу талдоо.Эки куйруктуу Globaltest колдонулган жана p маанилери Holm-Bonferroni ыкмасы менен туураланган (п ≤ 0,001 жана эффект өлчөмү > 0,01 түзөтүлгөн).b-d LC-MS/MS тарабынан аныкталган кан сары суусунун HC, BN жана LAдагы гипоксантин, ксантин, лактат, пируват жана триптофан деңгээлин көрсөткөн скрипка сюжеттери (n = 70 топко).Ак жана кара чекиттүү сызыктар тиешелүүлүгүнө жараша медиананы жана квартилди көрсөтөт.e LUAD-TCGA маалымат топтомундагы кадимки өпкө тканына (n = 59) салыштырмалуу өпкө аденокарциномасында (n = 513) SLC7A5 жана QPRT нормалдаштырылган Log2TPM (миллионго транскрипт) mRNA экспрессиясын көрсөткөн скрипка сюжети.Ак куту квартал аралык диапазону, борбордогу горизонталдуу кара сызык медиананы, ал эми кутудан чыккан вертикалдуу кара сызык 95% ишеним аралыгын (CI) билдирет.TCGA маалымат топтомундагы өпкө аденокарциномасында (n = 513) жана кадимки өпкө тканында (n = 59) SLC7A5 жана GAPDH экспрессиясынын Пирсон корреляциясынын сюжети.Боз аймак 95% CI түзөт.r, Пирсон корреляция коэффициенти.g LC-MS/MS тарабынан аныкталган спецификалык эмес shRNA башкаруу (NC) жана shSLC7A5 (Sh1, Sh2) менен transfected A549 клеткаларындагы нормалдаштырылган уюлдук триптофан деңгээл.Ар бир топтогу беш биологиялык көз карандысыз үлгүлөрдүн статистикалык анализи берилген.h A549 клеткаларындагы (NC) жана SLC7A5 кулатуучу A549 клеткаларындагы (Sh1, Sh2) NADt (жалпы NAD, анын ичинде NAD+ жана NADH) уюлдук деңгээли.Ар бир топтогу үч биологиялык көз карандысыз үлгүлөрдүн статистикалык анализи берилген.i A549 клеткаларынын SLC7A5 кулатканга чейинки жана андан кийинки гликолитикалык активдүүлүгү клеткадан тышкаркы кычкылдануу ылдамдыгы (ECAR) менен өлчөнгөн (n = 4 биологиялык көзкарандысыз үлгүлөр).2-DG,2-дезокси-D-глюкоза.Эки куйруктуу Студенттин t тести (b–h) колдонулган.(g-i), ката тилкелери орточо ± SDди билдирет, ар бир эксперимент үч жолу өз алдынча аткарылган жана натыйжалар окшош болгон.Булак маалыматтар баштапкы маалымат файлдары түрүндө берилет.
LA тобунда өзгөртүлгөн триптофан метаболизминин олуттуу таасирин эске алуу менен, биз ошондой эле QQQ аркылуу HC, BN жана LA топторундагы плазмадагы триптофан деңгээлин бааладык.Биз кандагы триптофандын HC же BN менен салыштырганда ЛАда азайгандыгын таптык (p <0.001, 5d сүрөт), бул жүгүртүүдөгү триптофан деңгээли өпкөнүн рагы менен ооруган бейтаптарда контролдук топтун дени сак кишилерине караганда төмөн экендиги жөнүндө мурунку жыйынтыктарга шайкеш келет33,34 ,35.PET/CT tracer 11C-methyl-L-tryptophan колдонуу менен дагы бир изилдөө өпкө рагы кыртышында триптофан сигнал кармап калуу убактысы бир кыйла жакшы жабыркашы же кадимки кыртыштын36 салыштырмалуу жогорулаган деп табылган.Биз LA сывороткасындагы триптофандын азайышы өпкөнүн рак клеткалары тарабынан активдүү триптофан кабыл алынышын чагылдырышы мүмкүн деп болжолдойбуз.
Ошондой эле триптофан катаболизминин кинурениндик жолунун акыркы продуктусу NAD+37,38 экендиги белгилүү, ал гликолиздеги глицеральдегид-3-фосфаттын 1,3-бисфосфоглицерат менен реакциясы үчүн маанилүү субстрат болуп саналат39.Мурунку изилдөөлөр иммундук жөнгө салууда триптофан катаболизминин ролуна багытталган, бирок биз учурдагы изилдөөдө байкалган триптофан дисрегуляциясы менен гликолитикалык жолдордун ортосундагы өз ара байланышты түшүндүрүүгө аракет кылдык.Эритүүчү затты ташуучу үй-бүлө 7 мүчө 5 (SLC7A5) триптофан ташуучу43,44,45 экендиги белгилүү.Хинолин кислотасын фосфорибосилтрансфераза (QPRT) - хинолин кислотасын NAMN46га айландыруучу кинуренин жолунун ылдый жагында жайгашкан фермент.LUAD TCGA маалыматтар топтомун текшерүү SLC7A5 жана QPRT экөө тең кадимки кыртыштарга салыштырмалуу шишик кыртышында бир кыйла жогорулаганын көрсөттү (сүрөт 5e).Бул өсүш I жана II этаптарында, ошондой эле өпкө аденокарциномасынын III жана IV этаптарында байкалган (Кошумча 11-сүрөт), бул шишик пайда болушу менен байланышкан триптофан метаболизминин эрте бузулушун көрсөтүп турат.
Кошумча, LUAD-TCGA маалымат топтому рак менен ооруган үлгүлөрдөгү SLC7A5 жана GAPDH mRNA туюнтмасынын ортосундагы оң корреляцияны көрсөттү (r = 0.45, б = 1.55E-26, Figure 5f).Ал эми, кадимки өпкө кыртышында мындай ген кол ортосунда эч кандай олуттуу байланыш табылган жок (r = 0.25, б = 0.06, Figure 5f).A549 клеткаларындагы SLC7A5 (Кошумча 12-сүрөт) кулашы клеткалык триптофан жана NAD(H) деңгээлин (5g,h-сүрөт) бир топ төмөндөтүп, клеткадан тышкаркы кычкылдануу ылдамдыгы (ECAR) менен өлчөнгөн гликолитикалык активдүүлүктүн начарлашына алып келди (1-сүрөт).5i).Ошентип, сывороткадагы метаболикалык өзгөрүүлөрдүн жана in vitro аныктоонун негизинде, биз триптофан метаболизми кинуренин жолу аркылуу NAD + түзүшү мүмкүн жана өпкө рагына гликолизди илгерилетүүдө маанилүү ролду ойной алат деп болжолдойбуз.
Изилдөөлөр көрсөткөндөй, LDCT тарабынан аныкталган көп сандагы аныкталбаган өпкө түйүндөрү PET-CT, өпкөнүн биопсиясы жана ашыкча дарылоо сыяктуу кошумча тесттерге муктаждыкка алып келиши мүмкүн, анткени жалган оң диагноз коюлган.31 6-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, биздин изилдөө КТ тарабынан аныкталган өпкө түйүндөрүнүн тобокелдик стратификациясын жана андан кийинки башкарууну жакшыртууга мүмкүн болуучу диагностикалык мааниге ээ сывороткадагы метаболиттер тобун аныктады.
Өпкө түйүндөрүнүн начар же зыяндуу себептерин көрсөткөн сүрөттөө өзгөчөлүктөрү менен төмөн дозалуу компьютердик томография (LDCT) менен бааланат.Түйүндөрдүн белгисиз натыйжасы тез-тез кайталанууга, керексиз кийлигишүүгө жана ашыкча дарылоого алып келиши мүмкүн.Диагностикалык мааниге ээ сывороткадагы метаболикалык классификаторлорду киргизүү өпкө түйүндөрүнүн тобокелдигин баалоону жана андан кийин башкарууну жакшыртышы мүмкүн.ПЭТ позитрондук эмиссиялык томография.
АКШнын NLST изилдөөсүнүн жана европалык NELSON изилдөөлөрүнүн маалыматтары төмөн дозалуу компьютердик томография (LDCT) менен жогорку тобокелдик топторун скрининг өпкө рагы өлүмүн азайтышы мүмкүн экенин көрсөтүп турат1,3.Бирок, LDCT тарабынан аныкталган кокустан өпкө түйүндөрүнүн көп сандагы тобокелдигин баалоо жана андан кийинки клиникалык башкаруу эң татаал бойдон калууда.Негизги максат - ишенимдүү биомаркерлерди киргизүү аркылуу учурдагы LDCT негизиндеги протоколдордун туура классификациясын оптималдаштыруу.
Кээ бир молекулярдык биомаркерлер, мисалы, кандын метаболиттери, өпкө рагын дени сак контролдор менен салыштыруу жолу менен аныкталган.Учурдагы изилдөөдө биз LDCT тарабынан кокустан аныкталган зыянсыз жана зыяндуу өпкө түйүндөрүн айырмалоо үчүн сывороткадагы метаболомика анализин колдонууга багытталган.Биз UPLC-HRMS анализин колдонуу менен дени сак контролдун (HC), жакшы өпкө түйүндөрүнүн (BN) жана I этаптагы өпкө аденокарциномасынын (LA) үлгүлөрүнүн глобалдык сывороткасын салыштырдык.Биз LA HC жана BN салыштырмалуу олуттуу өзгөрүүлөрдү көрсөттү, ал эми HC жана BN окшош метаболизм таржымалын бар экенин байкашкан.Биз ЛАны HC жана BNден айырмалай турган сывороткадагы метаболиттердин эки топтомун аныктадык.
Учурдагы LDCT негизинде зыянсыз жана зыяндуу түйүндөрдү идентификациялоо схемасы негизинен түйүндөрдүн көлөмүнө, тыгыздыгына, морфологиясына жана убакыттын өтүшү менен өсүү темпине негизделген30.Мурунку изилдөөлөр түйүндөрдүн өлчөмү өпкө рагынын ыктымалдыгы менен тыгыз байланышта экенин көрсөттү.Ал тургай, жогорку тобокелдик менен ооруган бейтаптар, түйүндөрдүн <6 мм коркунучу <1% түзөт.6дан 20 ммге чейинки түйүндөрдүн залалдуу болуу коркунучу 8% дан 64% га чейин30.Ошондуктан, Fleischner Society күнүмдүк КТ байкоо үчүн 6 мм кесүү диаметри сунуш кылат.29 Бирок, тобокелдикти баалоо жана аныктоо эмес өпкө түйүндөрүнүн башкаруу (IPN) 6 мм көбүрөөк жетиштүү 31 аткарылган эмес.Тубаса жүрөк оорусун учурдагы башкаруу, адатта, КТ мониторинги менен сергек күтүүгө негизделген.
Текшерилген метаболомдун негизинде биз биринчи жолу дени сак адамдар менен <6 ммден кем эмес түйүндөрдүн ортосундагы метаболомикалык кол тамгалардын дал келишин көрсөттүк.Биологиялык окшоштук КТнын мурунку корутундулары менен шайкеш келет: <6 мм түйүндөрдүн залалдуу болуу коркунучу түйүндөрү жок субъектилердей эле төмөн. метаболомикалык профилдердин окшоштугу, зыянсыз этиологиянын функционалдык аныктамасы түйүндөрдүн өлчөмүнө карабастан ырааттуу экендигин билдирет.Ошентип, заманбап диагностикалык сыворотка метаболитинин панелдери КТ боюнча түйүндөр адегенде аныкталганда жана сериялык мониторингди азайтса, бир анализди алып салуучу тест катары камсыздай алат.Ошол эле учурда метаболизмдик биомаркерлердин бир эле панели залалсыз түйүндөрдөн ≥6 мм өлчөмүндөгү залалдуу түйүндөрдү айырмалап, КТ сүрөттөрүндө окшош өлчөмдөгү IPN жана бүдөмүк морфологиялык өзгөчөлүктөр үчүн так болжолдоолорду берген.Бул сывороткадагы метаболизм классификатору 0,927 AUC менен ≥6 мм түйүндөрдүн залалдуулугун алдын ала жакшы аткарды.Чогуу алганда, биздин натыйжалар уникалдуу сывороткадагы метаболомикалык кол тамгалар шишиктен келип чыккан метаболизмдин алгачкы өзгөрүүлөрүн өзгөчө чагылдырышы мүмкүн экенин жана түйүндөрдүн өлчөмүнөн көз карандысыз тобокелдикти болжолдоочу катары потенциалдуу мааниге ээ экенин көрсөтүп турат.
Белгилей кетсек, өпкө аденокарциномасы (LUAD) жана сквама клеткалуу карцинома (LUSC) майда эмес клеткалуу өпкө рагына (NSCLC) негизги түрлөрү болуп саналат.LUSC тамеки чегүү менен тыгыз байланышта экенин жана LUAD КТ скринингинде 48 табылган кокус өпкө түйүндөрүнүн эң кеңири таралган гистологиясы экенин эске алып, биздин классификатор моделибиз I стадиядагы аденокарцинома үлгүлөрү үчүн атайын курулган.Wang жана кесиптештери ошондой эле LUAD багытталган жана дени сак адамдардан өпкө рагын алгачкы стадиясында айырмалоо үчүн lipidomics колдонуу менен тогуз липиддердин кол аныкталган.Биз учурдагы классификатордун моделин 16 стадиядагы LUSC жана 74 жакшы түйүндөр боюнча сынап көрдүк жана LUAD жана LUSC өз метаболомикалык кол тамгаларына ээ болушу мүмкүн деген LUSC болжолдоо тактыгынын төмөндүгүн байкадык (AUC 0.776).Чынында эле, LUAD жана LUSC этиологиясы, биологиялык келип чыгышы жана генетикалык аберрациялары боюнча айырмаланат49.Ошондуктан, гистологиянын башка түрлөрү скрининг программаларында өпкө рагын калктын негизинде аныктоо үчүн окутуу моделдерине киргизилиши керек.
Бул жерде биз өпкө аденокарциномасында эң көп өзгөргөн алты жолду дени сак контролдоочуларга жана зыянсыз түйүндөргө салыштырдык.Ксантин жана гипоксантин пуриндик метаболизм жолунун жалпы метаболиттери болуп саналат.Биздин натыйжаларга ылайык, пурин метаболизми менен байланышкан интермедиаттар өпкө аденокарциномасы менен ооругандардын сывороткасы же ткандарында дени сак контролдоочуларга же preinvasive стадиясында 15,50 бейтаптарга салыштырмалуу бир кыйла көбөйгөн.Ксантиндин жана гипоксантиндин сыворотканын деңгээлинин жогорулашы тез көбөйүп жаткан рак клеткалары талап кылган анаболизмди чагылдырышы мүмкүн.Глюкозанын метаболизминин бузулушу рактын метаболизминин белгилүү белгиси болуп саналат51.Бул жерде биз HC жана BN тобуна салыштырмалуу LA тобунда пируваттын жана лактаттын бир кыйла көбөйгөнүн байкадык, бул майда эмес клеткалык өпкө рагы (NSCLC) менен ооругандардын сары суунун метаболом профилдериндеги гликолитикалык жол аномалиялары жөнүндө мурунку отчетторго шайкеш келет. дени сак башкаруу.натыйжалар ырааттуу 52,53.
Маанилүү нерсе, биз өпкө аденокарциномаларынын сывороткасындагы пируват жана триптофан метаболизминин ортосундагы тескери корреляцияны байкадык.Сывороткадагы триптофан деңгээли HC же BN тобуна салыштырмалуу LA тобунда кыскарган.Кызыктуусу, келечектүү когортту колдонуу менен мурунку масштабдуу изилдөө жүгүртүүдөгү триптофандын төмөн деңгээли өпкө рагы 54 рискин жогорулашы менен байланышкан.Триптофан - бул биз тамак-аштан алган маанилүү аминокислота.Биз өпкө аденокарциномасында триптофандын сыворотканын азайышы бул метаболиттин тез түгөнүп кетишин чагылдырышы мүмкүн деген жыйынтыкка келебиз.Кинуренин жолу аркылуу триптофан катаболизминин акыркы продуктусу NAD+ синтезинин булагы экени белгилүү.NAD+ биринчи кезекте куткаруу жолу аркылуу өндүрүлгөндүктөн, NAD+ ден соолукта жана ооруда триптофандын метаболизминдеги мааниси аныктала элек.TCGA маалымат базасын биздин талдоо триптофан ташуучу эритүүчү транспортер 7A5 (SLC7A5) экспрессиясы кадимки башкаруу менен салыштырганда өпкө аденокарциномасында олуттуу жогорулаганын жана GAPDH гликолитикалык энзиминин экспрессиясы менен оң корреляцияланганын көрсөттү.Мурунку изилдөөлөр негизинен антитумор иммундук жооп 40,41,42 басуу триптофан катаболизминин ролуна багытталган.Бул жерде биз өпкөнүн рак клеткаларында SLC7A5 тыныгуу жолу менен триптофандын кабыл алынышын токтотуу клеткалык NAD деңгээлинин кийинки төмөндөшүнө жана гликолитикалык активдүүлүктүн ошол эле учурда басаңдашына алып келерин көрсөтөбүз.Жыйынтыктап айтканда, биздин изилдөө өпкө аденокарциномасынын залалдуу трансформациясы менен байланышкан сывороткадагы метаболизмдеги өзгөрүүлөрдүн биологиялык негизин түзөт.
EGFR мутациялары NSCLC менен ооругандардын эң кеңири таралган айдоочу мутациялары болуп саналат.Биздин изилдөөбүздө, биз EGFR мутация менен ооруган бейтаптар (n = 41) жапайы типтеги EGFR (n = 31) менен ооруган бейтаптарга окшош жалпы метаболомикалык таржымалын бар экенин, бирок биз acylcarnitine бейтаптарда кээ бир EGFR мутант бейтаптардын сывороткасы көлөмүн кыскарган табылган.Ацилкарнитиндердин белгиленген функциясы цитоплазмадан ацил топторун митохондриялык матрицага ташып, май кислоталарынын кычкылданышына алып келип, энергия 55 болуп саналат.Биздин табылгаларыбызга ылайык, жакында жүргүзүлгөн изилдөө 102 өпкө аденокарциномасынын кыртышынын үлгүлөрүнүн 50 глобалдык метаболомун талдоо аркылуу EGFR мутантынын жана EGFR жапайы типтеги шишиктеринин ортосундагы окшош метаболом профилдерин аныктады.Кызыктуусу, acylcarnitine мазмуну EGFR мутант тобунда да табылган.Ошондуктан, acylcarnitine деъгээлинде өзгөрүүлөр EGFR менен шартталган зат алмашуу өзгөрүүлөрдү чагылдырат жана негизги молекулярдык жолдору мындан ары изилдөө татыктуу болушу мүмкүн.
Жыйынтыктап айтканда, биздин изилдөө өпкө түйүндөрүнүн дифференциалдык диагностикасы үчүн сывороткадагы метаболикалык классификаторду түздү жана КТ сканерлөөнүн негизинде тобокелдикти баалоону оптималдаштыруу жана клиникалык башкарууну жеңилдете турган иш агымын сунуштайт.
Бул изилдөө Сун Ятсен университетинин онкологиялык ооруканасынын этика комитети, Сун Ятсен университетинин биринчи филиалы жана Чжэнчжоу университетинин онкологиялык ооруканасынын этика комитети тарабынан жактырылган.Ачылыш жана ички валидациялык топтордо дени сак адамдардан 174 сыворотка жана ракты көзөмөлдөө жана алдын алуу бөлүмүндө, Сун Ят-сен университетинин Онкология борборунда жыл сайын медициналык текшерүүдөн өтүп жаткан адамдардан жана 166 зыянсыз түйүндөрдөн 244 сарык чогултулду.сыворотка.I этаптагы өпкө аденокарциномалары Сун Ят-сен университетинин онкология борборунан чогултулган.Тышкы валидация когортунда залалсыз түйүндөрдүн 48 учуру, Сун Ят-сен университетинин биринчи филиалынан 39 стадиядагы өпкө аденокарциномасынын жана Чжэнчжоу онкологиялык ооруканасынан I стадиядагы өпкө аденокарциномасынын 24 учуру болгон.Сун Ят-сен университетинин онкология борбору ошондой эле белгиленген метаболикалык классификатордун диагностикалык жөндөмдүүлүгүн текшерүү үчүн I стадиядагы сквамоз клеткалуу өпкө рагынын 16 учурун чогулткан (оорулуунун мүнөздөмөлөрү 5-кошумча таблицада көрсөтүлгөн).Ачылыш когортунун жана ички валидациялык когорттун үлгүлөрү 2018-жылдын январь айынан 2020-жылдын май айына чейин чогултулган. Тышкы валидация когортунун үлгүлөрү 2021-жылдын августунан 2022-жылдын октябрына чейин чогултулган. Гендердик көз карашты азайтуу үчүн, ар бирине болжол менен бирдей сандагы эркек жана аял учурлары дайындалган. когорта.Discovery командасы жана ички текшерүү тобу.Катышуучунун жынысы өздүк отчеттун негизинде аныкталган.Бардык катышуучулардан маалымдалган макулдук алынган жана эч кандай компенсация каралган эмес.Операциядан мурун чогултулган жана гистопатология менен диагноз коюлган тышкы валидация үлгүсүндөгү 1 учурду кошпогондо, зыянсыз түйүндөрү бар субъекттер анализ учурунда 2 жылдан 5 жылга чейин туруктуу КТ сканерлөө баллына ээ болгондор болгон.Өнөкөт бронхиттен тышкары.Өпкө аденокарцинома учурлары өпкө резекциясына чейин чогултулган жана патологиялык диагноз менен тастыкталган.Орозо кан үлгүлөрү эч кандай антикоагулянттарсыз сыворотка бөлүүчү түтүктөргө чогултулган.Кан үлгүлөрү 1 саат бөлмө температурасында уюп, андан кийин 2851 × г центрифугада 4°C 10 мүнөттө сыворотка супернатанты чогултулду.Сывороткадагы аликвоттар -80°Cде метаболит экстракцияланганга чейин тоңдурулган.Сун Ят-сен университетинин онкология борборунун рактын алдын алуу жана медициналык экспертиза бөлүмү 100 дени сак донордон, анын ичинде 40 жаштан 55 жашка чейинки бирдей сандагы эркектер менен аялдардан сыворотка чогулткан.Ар бир донордук үлгүнүн бирдей көлөмдөрү аралаштырылды, натыйжада көлмөгө бөлүнүп, -80°Cде сакталды.Сыворотка аралашмасы сапатты көзөмөлдөө жана маалыматтарды стандартташтыруу үчүн маалымдама материалы катары колдонулган.
Маалымдама сывороткасы жана тест үлгүлөрү эритүү жана метаболиттерди бириктирилген экстракция ыкмасын (MTBE/метанол/суу) 56 колдонуп алынган.Кыскача айтканда, 50 мкл сыворотка 225 мкл муздак метанол жана 750 мкл муздак метил терт-бутил эфири (MTBE) менен аралаштырылды.Аралашманы аралаштырып, музда 1 саат инкубациялаңыз.Андан кийин үлгүлөр аралаштырылган жана ички стандарттарды камтыган MS классындагы 188 мкл суу менен аралаштырылды (13С-лактат, 13С3-пируват, 13С-метионин жана 13С6-изолейцин, Кембридж Изотоп лабораторияларынан сатылып алынган).Андан кийин аралашма 15,000 × г центрифугада 10 мүнөт 4 °C, ал эми төмөнкү фаза оң жана терс режимдерде LC-MS талдоо үчүн эки түтүкчөлөргө (ар бири 125 мкл) өткөрүлүп берилди.Акырында үлгү жогорку ылдамдыктагы вакуумдук концентратордо кургакчылыкка чейин бууланды.
Кургатылган метаболиттер 120 мкл 80% ацетонитрилде кайра түзүлүп, 5 мүнөт вортекстелип, 15 000 × г центрифугада 4°Cде 10 мүнөткө өткөрүлдү.Супернатанттар метаболомиканы изилдөө үчүн микросалмалары бар сары айнек флакондорго которулду.Ультра эффективдүү суюк хроматография-жогорку чечим масс-спектрометрия (UPLC-HRMS) платформасында максатсыз метаболомика анализи.Метаболиттер Dionex Ultimate 3000 UPLC системасы жана ACQUITY BEH Амид мамычасы (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Суу) аркылуу бөлүнгөн.Оң иондук режимде кыймылдуу фазалар 95% (А) жана 50% ацетонитрил (В) болгон, ар биринде 10 ммоль/л аммоний ацетаты жана 0,1% кумурска кислотасы бар.Терс режимде мобилдик фазалар А жана В 95% жана 50% ацетонитрилди камтыган, эки фазада тең 10 ммоль/л аммоний ацетаты бар, рН = 9. Градиент программасы төмөнкүдөй болгон: 0-0,5 мин, 2% B;0,5–12 мин, 2–50% B;12–14 мин, 50–98% B;14–16 мин, 98% В;16–16.1.мин, 98 –2% B;16,1–20 мин, 2% B. Колонка 40°C жана үлгү 10°C автоүлгүдөгүчтө сакталган.агымынын ылдамдыгы 0,3 мл/мин, инъекция көлөмү 3 мкл болгон.Электр спрей иондоштуруу (ESI) булагы бар Q-Exactive Orbitrap масс-спектрометри (Thermo Fisher Scientific) толук сканерлөө режиминде жана ddMS2 мониторинг режими менен бирге чоң көлөмдөгү маалыматтарды чогултуу үчүн иштетилди.MS параметрлери төмөнкүчө белгиленген: чачуу чыңалуу +3,8 кВ/- 3,2 кВ, капиллярдык температура 320°С, коргоочу газ 40 арб, көмөкчү газ 10 арб, зонд жылыткычынын температурасы 350°C, сканерлөө диапазону 70–1050 м/саат, резолюция.70 000. Маалыматтар Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) аркылуу алынган.
Маалыматтын сапатын баалоо үчүн, ар бир үлгүдөн супернатанттын 10 мкл аликвотторун алып салуу менен топтолгон сапатты көзөмөлдөө (QC) үлгүлөрү түзүлдү.UPLC-MS тутумунун туруктуулугун баалоо үчүн аналитикалык ырааттуулуктун башында алты сапатты көзөмөлдөө үлгүсүнүн инъекциялары талданды.Андан кийин сапатты контролдоо үлгүлөрү мезгил-мезгили менен партияга киргизилет.Бул изилдөөдөгү сыворотка үлгүлөрүнүн бардык 11 партиясы LC-MS тарабынан талданды.100 дени сак донордон алынган сыворотка бассейнинин аралашмасынын аликвоттору экстракциялоо процессине мониторинг жүргүзүү жана партиядан партияга эффекттерди тууралоо үчүн тиешелүү партияларда эталондук материал катары колдонулган.Сун Ят-сен университетинин Метаболомика борборунда ачылыш когортунун, ички валидациялык когорттун жана тышкы валидация когортунун максатсыз метаболомикасынын анализи жүргүзүлгөн.Гуандун университетинин технологиялык анализ жана тестирлөө борборунун тышкы лабораториясы да классификатор моделинин иштешин текшерүү үчүн тышкы когорттан 40 үлгүнү талдады.
Экстракциялоодон жана калыбына келтирүүдөн кийин кан сары суунун метаболиттеринин абсолюттук саны бир нече реакцияга мониторинг (MRM) режиминде электроспрей иондоштуруу (ESI) булагы менен ультра жогорку натыйжалуу суюк хроматография-тандем масс-спектрометриясынын (Agilent 6495 үч эселенген төрт полюс) жардамы менен өлчөнгөн.Метаболиттерди бөлүү үчүн ACQUITY BEH амид колонкасы (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters) колдонулган.Мобилдик фаза 90% (А) жана 5% ацетонитрилден (В) 10 ммоль/л аммоний ацетаты жана 0,1% аммиак эритмесинен турган.Градиент программасы төмөнкүдөй болгон: 0–1,5 мин, 0% B;1,5–6,5 мин, 0–15% B;6,5–8 мин, 15% В;8–8,5 мин, 15%–0% B;8,5–11,5 мин, 0%В.Колонка 40 °C температурада жана үлгү 10 °C автоүлгүдөгүчтө сакталган.агымынын ылдамдыгы 0,3 мл/мин жана сайынуу көлөмү 1 мкл болгон.MS параметрлери төмөнкүдөй орнотулган: капиллярдык чыңалуу ±3,5 кВ, небулайзер басымы 35 psi, кабык газынын агымы 12 л/мин, кабык газынын температурасы 350°C, кургатуу газынын температурасы 250°C, кургаткыч газдын агымы 14 л/мин.Триптофан, пируват, лактат, гипоксантин жана ксантиндин MRM конверсиялары 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 жана 151,0–107 болгон.9 тиешелүү.Маалыматтар Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) аркылуу чогултулган.Сыворотка үлгүлөрү үчүн триптофан, пируват, лактат, гипоксантин жана ксантин стандарттык аралашма эритмелеринин калибрлөө ийри сызыктары аркылуу сандык аныкталды.Клетка үлгүлөрү үчүн триптофан мазмуну ички стандартка жана клетка протеининин массасына нормалдаштырылган.
Чокусу экстракция (m/z жана кармап калуу убактысы (RT)) Compound Discovery 3.1 жана TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) аркылуу аткарылган.Партиялардын ортосундагы потенциалдуу айырмачылыктарды жоюу үчүн, салыштырмалуу көптүктү алуу үчүн, сыноо үлгүсүнүн ар бир мүнөздүү чокусу ошол эле партиядан алынган эталондук материалдын мүнөздүү чокусуна бөлүнгөн.Стандартташтырууга чейинки жана андан кийинки ички стандарттардын салыштырмалуу стандарттык четтөөлөрү Кошумча таблицада 6-таблицада көрсөтүлгөн. Эки топтун ортосундагы айырмачылыктар жалган ачуу ылдамдыгы (FDR<0,05, Wilcoxon кол коюлган ранг сынагы) жана бүктөмдүн өзгөрүшү (>1,2 же <0,83) менен мүнөздөлгөн.Чыгарылган өзгөчөлүктөрдүн чийки MS маалыматтары жана маалымдама сывороткасы менен оңдолгон MS маалыматтары тиешелүүлүгүнө жараша Кошумча маалыматтарда 1 жана Кошумча маалыматтарда көрсөтүлгөн.Чокусу аннотация аныкталган метаболиттер, болжолдуу аннотацияланган кошулмалар, болжолдуу мүнөздөлгөн татаал класстар жана белгисиз кошулмалар 22, анын ичинде аныктоонун төрт аныкталган денгээлинин негизинде аткарылган.Compound Discovery 3.1де (mzCloud, HMDB, Chemspider) маалымат базасын издөөнүн негизинде, MS/MS верификацияланган стандарттарга дал келген биологиялык кошулмалар же mzCloud (упай > 85) же Chemspiderдеги так дал келүү аннотациялары дифференциалдык метаболомдун ортосундагы аралык катары акыры тандалды.Ар бир өзгөчөлүк үчүн эң жогорку аннотациялар Кошумча маалыматтарга 3 киргизилген. MetaboAlyst 5.0 сумманы нормалдаштырылган метаболиттердин көптүгүнүн бир өзгөрмөлүү анализи үчүн колдонулган.MetaboAnalyst 5.0 ошондой эле бир кыйла ар түрдүү метаболиттердин негизинде KEGG жолун байытуу анализин баалады.Негизги компоненттердин анализи (PCA) жана жарым-жартылай эң кичине квадраттардын дискриминанттык анализи (PLS-DA) стек нормалдаштыруу жана автоскалдаштыруу менен ropls программалык пакетин (v.1.26.4) колдонуу менен талданды.Түйүндөрдүн залалдуулугун болжолдоо үчүн оптималдуу метаболит биомаркер модели эң аз абсолюттук кичирейүү жана тандоо оператору (LASSO, R пакети v.4.1-3) менен бинардык логистикалык регрессияны колдонуу менен түзүлгөн.Дискриминанттык моделдин аныктоо жана валидация топтомдорундагы аткаруусу pROC пакетине (v.1.18.0.) ылайык ROC анализинин негизинде AUCти баалоо менен мүнөздөлгөн.Ыктымалдуулуктун оптималдуу кесилиши моделдин максималдуу Юден индексинин негизинде алынган (сезимдүүлүк + өзгөчөлүк – 1).Босогодон аз же жогору болгон үлгүлөр, тиешелүүлүгүнө жараша, жакшы түйүндөр жана өпкө аденокарциномасы катары болжолдонот.
A549 клеткалары (#CCL-185, American Type Culture Collection) 10% FBS камтыган F-12K чөйрөсүндө өстүрүлгөн.SLC7A5 багытталган кыска чачтуу РНК (shRNA) ырааттуулугу жана максатсыз башкаруу (NC) pLKO.1-puro lentiviral векторуна киргизилген.shSLC7A5тин антисенстик ырааттуулугу төмөнкүдөй: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).SLC7A5 (#5347) жана тубулинге (#2148) антителолор Cell Signaling Technology компаниясынан сатылып алынган.SLC7A5 жана тубулинге каршы антителолор 1:1000 суюлтууда Вестерн-блот анализи үчүн колдонулган.
Seahorse XF Glycolytic Stress Test клеткадан тышкары кычкылдануу (ECAR) деңгээлин өлчөйт.Талдоодо глюкоза, олигомицин А жана 2-DG ECAR менен өлчөнгөн клетканын гликолиттик сыйымдуулугун текшерүү үчүн ырааттуу түрдө берилди.
максаттуу эмес башкаруу (NC) жана shSLC7A5 (Sh1, Sh2) менен transfected A549 клеткалары 10 см диаметри идиштерге түнү менен капталган.Клетка метаболиттери 1 мл муздак 80% суулуу метанол менен экстракцияланган.Метанол эритмесиндеги клеткалар кырылып, жаңы түтүккө чогултулуп, 15000 × г центрифугада 4°Cде 15 мүнөткө өткөрүлдү.800 мкл супернатантты чогултуп, жогорку ылдамдыктагы вакуумдук концентратордун жардамы менен кургатыңыз.Кургатылган метаболит гранулдары андан кийин жогоруда сүрөттөлгөндөй LC-MS/MS колдонуу менен триптофан деңгээлине талданышты.A549 клеткаларындагы (NC жана shSLC7A5) клеткалык NAD(H) деңгээлдери өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык сандык NAD+/NADH колориметрдик комплект (#K337, BioVision) менен өлчөнгөн.Метаболиттердин көлөмүн нормалдаштыруу үчүн ар бир үлгү үчүн протеиндин деңгээли ченелген.
Тандоо өлчөмүн алдын ала аныктоо үчүн статистикалык ыкмалар колдонулган эмес.Биоморкерди табууга багытталган мурунку метаболомика изилдөөлөрү 15,18 өлчөмүн аныктоо үчүн эталондор катары каралып, бул отчеттор менен салыштырганда, биздин үлгү адекваттуу болгон.Эч кандай үлгүлөр изилдөө когортасынан чыгарылган.Сыворотка үлгүлөрү туш келди ачылыш тобуна (306 учурлар, 74,6%) жана максатсыз метаболомика изилдөөлөр үчүн ички текшерүү тобуна (104 учурлар, 25,4%) дайындалган.Биз ошондой эле максаттуу метаболомика изилдөөлөрү үчүн коюлган ачылыштан ар бир топтон 70 учурду тандадык.Тергөөчүлөр LC-MS маалыматтарды чогултуу жана талдоо учурунда топтук тапшырманы көрүшпөй калышты.Метаболомика маалыматтарынын жана клетка эксперименттеринин статистикалык талдоолору тиешелүү Жыйынтыктар, Сүрөт Легендалары жана Методдор бөлүмдөрүндө баяндалат.Уюлдук триптофан, NADT жана гликолитикалык активдүүлүктүн сандык көрсөткүчү бирдей натыйжалар менен үч жолу өз алдынча аткарылган.
Изилдөөнүн дизайны жөнүндө көбүрөөк маалымат алуу үчүн, бул макала менен байланышкан Табигый портфолио отчетунун абстракциясын караңыз.
Чыгарылган өзгөчөлүктөрдүн чийки MS маалыматтары жана маалымдама сыворотканын нормалдаштырылган MS маалыматтары тиешелүүлүгүнө жараша Кошумча маалыматтарда 1 жана Кошумча маалыматтарда көрсөтүлгөн.Дифференциалдык өзгөчөлүктөр үчүн эң жогорку аннотациялар Кошумча маалыматтар 3-де берилген. LUAD TCGA маалымат топтомун https://portal.gdc.cancer.gov/ дарегинен жүктөп алса болот.Графикти түзүү үчүн кириш маалыматтар баштапкы маалыматтарда берилген.Бул макала үчүн булак маалыматтар берилген.
Өпкөнүн скрининги боюнча улуттук изилдөө тобу, ж.б. төмөн дозалуу компьютердик томография менен өпкө рагынан өлүмдү азайтуу.Түндүк Англия.Ж. Мед.365, 395–409 (2011).
Крамер, BS, Berg, KD, Aberle, DR жана Пайгамбар, PC Өпкө рагынын скрининги төмөн дозалуу спираль КТ аркылуу: Улуттук Өпкө Скрининг Изилдөөнүн натыйжалары (NLST).Ж. Мед.Экран 18, 109–111 (2011).
Де Конинг, HJ, жана башкалар.Рандомизацияланган сыноодо көлөмдүү КТ скрининги менен өпкө рагы боюнча өлүмдү азайтуу.Түндүк Англия.Ж. Мед.382, 503–513 (2020).
Посттун убактысы: 2023-жылдын 18-сентябрына чейин