Компьютердик томография (КТ) аркылуу аныкталган өпкө түйүндөрүнүн дифференциалдык диагнозу клиникалык практикада дагы эле кыйынчылык жаратууда. Бул жерде биз дени сак контролдук топту, залалдуу эмес өпкө түйүндөрүн жана I стадиядагы өпкө аденокарциномасын камтыган 480 кан сары суусунун үлгүлөрүнүн глобалдык метаболомун мүнөздөйбүз. Аденокарциномалар уникалдуу метаболомикалык профилдерди көрсөтөт, ал эми залалдуу эмес түйүндөр менен дени сак адамдар метаболомикалык профилдерде жогорку окшоштуктарга ээ. Ачылыш тобунда (n = 306) залалдуу эмес жана залалдуу түйүндөрдү айырмалоо үчүн 27 метаболиттин жыйындысы аныкталган. Ички валидация (n = 104) жана тышкы валидация (n = 111) топторундагы дискриминанттык моделдин AUC тиешелүүлүгүнө жараша 0,915 жана 0,945 түзгөн. Жолду талдоо залалдуу эмес түйүндөргө жана дени сак контролдук топко салыштырмалуу өпкө аденокарциномасынын кан сары суусундагы триптофандын азайышы менен байланышкан гликолитикалык метаболиттердин көбөйгөнүн көрсөттү жана триптофандын сиңирилиши өпкө рагынын клеткаларында гликолизди күчөтөт деп божомолдоду. Биздин изилдөө КТ аркылуу аныкталган өпкө түйүндөрүнүн коркунучун баалоодо кан сары суусундагы метаболит биомаркерлеринин маанисин баса белгилейт.
Рак менен ооругандардын жашоо деңгээлин жогорулатуу үчүн эрте диагноз коюу абдан маанилүү. АКШнын Улуттук өпкө рагын скринингдөө сыноосунун (NLST) жана Европалык NELSON изилдөөсүнүн жыйынтыктары көрсөткөндөй, аз дозалуу компьютердик томография (LDCT) менен скрининг жүргүзүү жогорку тобокелдик топторунда өпкө рагынан өлүмдү бир топ азайта алат1,2,3. LDCT өпкө рагын скринингдөө үчүн кеңири колдонулгандан бери, симптомсуз өпкө түйүндөрүнүн кокусунан рентгенографиялык табылгаларынын жыштыгы көбөйүүдө4. Өпкө түйүндөрү диаметри 3 смге чейинки фокалдык тунуктук катары аныкталат5. Биз залалдуу шишиктин ыктымалдыгын баалоодо жана LDCTде кокусунан аныкталган көп сандагы өпкө түйүндөрү менен күрөшүүдө кыйынчылыктарга туш болобуз. КТнын чектелүүлүгү тез-тез кайталап текшерүүлөргө жана жалган оң натыйжаларга алып келиши мүмкүн, бул керексиз кийлигишүүгө жана ашыкча дарылоого алып келет6. Ошондуктан, өпкө рагын алгачкы этаптарында туура аныктоо жана баштапкы аныктоодо көпчүлүк залалсыз түйүндөрдү айырмалоо үчүн ишенимдүү жана пайдалуу биомаркерлерди иштеп чыгуу зарыл7.
Кандын (сыворотка, плазма, перифериялык кандын мононуклеардык клеткалары) комплекстүү молекулярдык анализи, анын ичинде геномика, протеомика же ДНК метилдениши8,9,10, өпкө рагынын диагностикалык биомаркерлерин ачууга болгон кызыгуунун өсүшүнө алып келди. Ошол эле учурда, метаболомика ыкмалары эндогендик жана экзогендик аракеттердин таасири астында болгон клеткалык акыркы продуктуларды өлчөйт жана ошондуктан оорунун башталышын жана натыйжасын алдын ала айтуу үчүн колдонулат. Суюк хроматография-тандемдик массалык спектрометрия (LC-MS) жогорку сезгичтиги жана чоң динамикалык диапазонунан улам метаболомиканы изилдөө үчүн кеңири колдонулган ыкма болуп саналат, ал ар кандай физикалык-химиялык касиеттери бар метаболиттерди камтый алат11,12,13. Плазманын/сыворотканын глобалдык метаболомикалык анализи өпкө рагынын диагнозу14,15,16,17 жана дарылоонун натыйжалуулугу менен байланышкан биомаркерлерди аныктоо үчүн колдонулганы менен,18 залалдуу жана залалдуу өпкө түйүндөрүн айырмалоо үчүн сыворотка метаболитинин классификаторлору дагы эле көп изилдене элек. -массивдүү изилдөөлөр.
Аденокарцинома жана жалпак клеткалуу карцинома – бул майда клеткалуу эмес өпкө рагынын (NSCLC) эки негизги түрү. Ар кандай КТ скрининг тесттери аденокарцинома өпкө рагынын эң кеңири таралган гистологиялык түрү экенин көрсөтүп турат1,19,20,21. Бул изилдөөдө биз дени сак контролдук топ, залалсыз өпкө түйүндөрү жана КТ менен аныкталган ≤3 см болгондорду кошо алганда, жалпысынан 695 кан сары суусунун үлгүлөрүндө метаболомикалык анализ жүргүзүү үчүн ультра натыйжалуу суюк хроматографияны – жогорку чечилиштеги массалык спектрометрияны (UPLC-HRMS) колдондук. I стадиядагы өпкө аденокарциномасын скринингдөө. Биз өпкө аденокарциномасын залалсыз түйүндөрдөн жана дени сак контролдук топтон айырмалаган кан сары суусунун метаболиттери панелин аныктадык. Жолду байытуу анализи триптофан жана глюкозанын метаболизминин анормалдуулугу залалсыз түйүндөр жана дени сак контролдук топко салыштырмалуу өпкө аденокарциномасында кеңири таралган өзгөрүүлөр экенин көрсөттү. Акырында, биз LDCT аркылуу аныкталган залалдуу жана залалсыз өпкө түйүндөрүн айырмалоо үчүн жогорку спецификалуу жана сезгичтикке ээ болгон кан сары суусундагы зат алмашуу классификаторун түзүп, валидацияладык, бул эрте дифференциалдык диагноз коюуга жана тобокелдикти баалоого жардам бериши мүмкүн.
Учурдагы изилдөөдө жынысы жана жашы боюнча дал келген кан сары суусунун үлгүлөрү 174 дени сак контролдук топтун, залалсыз өпкө түйүндөрү бар 292 бейтаптын жана I стадиядагы өпкө аденокарциномасы бар 229 бейтаптын ретроспективдүү түрдө чогултулган. 695 субъекттин демографиялык мүнөздөмөсү 1-кошумча таблицада көрсөтүлгөн.
1a-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, Сунь Ятсен университетинин онкология борборунда 174 дени сак контролдук (HC), 170 залалсыз түйүн (BN) жана 136 I стадиядагы өпкө аденокарциномасынын (LA) үлгүлөрүн камтыган жалпысынан 480 кан сары суусунун үлгүлөрү чогултулган. Өтө натыйжалуу суюк хроматография-жогорку чечилиштеги массалык спектрометрияны (UPLC-HRMS) колдонуу менен максаттуу эмес метаболомикалык профилдөө үчүн ачылыш когортасы. 1-кошумча сүрөттө көрсөтүлгөндөй, классификация моделин түзүү жана дифференциалдык жолду талдоону андан ары изилдөө үчүн LA жана HC, LA жана BN ортосундагы дифференциалдык метаболиттер аныкталган. Сунь Ятсен университетинин онкология борбору тарабынан чогултулган 104 үлгү жана башка эки оорукана тарабынан чогултулган 111 үлгү тиешелүүлүгүнө жараша ички жана тышкы валидациядан өткөн.
a Ачылыш когортасындагы изилдөө популяциясы ультра натыйжалуу суюк хроматография-жогорку чечилиштеги массалык спектрометрия (UPLC-HRMS) колдонулуп, глобалдык кан сары суусунун метаболомикалык анализинен өткөн. b Изилдөө когортасынан алынган 480 кан сары суусунун үлгүлөрүнүн жалпы метаболомунун жарым-жартылай эң кичине квадраттар дискриминанттык анализи (PLS-DA), анын ичинде дени сак контролдук топ (HC, n = 174), залалсыз түйүндөр (BN, n = 170) жана I стадиядагы өпкө аденокарциномасы (Лос-Анжелес, n = 136). +ESI, оң электроспрей иондоштуруу режими, -ESI, терс электроспрей иондоштуруу режими. c–e Эки берилген топто (эки куйруктуу Уилкоксондун белги коюлган ранг тести, жалган ачылыш ылдамдыгынын туураланган p мааниси, FDR <0.05) бир кыйла айырмаланган молчулугу бар метаболиттер кызыл (бүктөмдүн өзгөрүшү > 1.2) жана көк (бүктөмдүн өзгөрүшү <0.83) жанар тоонун графикасында көрсөтүлгөн. f LA жана BN ортосундагы аннотацияланган метаболиттердин санындагы олуттуу айырмачылыктарды көрсөткөн иерархиялык кластердик жылуулук картасы. Баштапкы маалыматтар баштапкы маалымат файлдары түрүндө берилет.
Ачылыш тобундагы 174 HC, 170 BN жана 136 LAнын жалпы кан сары суусундагы метаболом UPLC-HRMS анализи аркылуу талданган. Алгач биз сапатты көзөмөлдөө (QC) үлгүлөрү көзөмөлсүз негизги компоненттик анализдин (PCA) моделинин борборунда тыгыз топтолгонун көрсөтүп, учурдагы изилдөөнүн натыйжалуулугунун туруктуулугун тастыктайбыз (2-кошумча сүрөт).
1b-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, биз оң (+ESI) жана терс (−ESI) электроспрей иондоштуруу режимдеринде LA жана BN, LA жана HC ортосунда айкын айырмачылыктар бар экенин аныктадык. Бирок, +ESI жана -ESI шарттарында BN жана HC ортосунда эч кандай олуттуу айырмачылыктар табылган жок.
Биз LA менен HC ортосунда 382 дифференциалдык белгини, LA менен BN ортосунда 231 дифференциалдык белгини жана BN менен HC ортосунда 95 дифференциалдык белгини таптык (Уилкоксондун кол коюлган ранг тести, FDR <0,05 жана көп өзгөрүү >1,2 же <0,83) (.1c-e-сүрөт). . Чокулар маалымат базасына (mzCloud/HMDB/Chemspider китепканасы) каршы m/z мааниси, сактоо убактысы жана фрагментация массалык спектр издөөсү (методдор бөлүмүндө сүрөттөлгөн) боюнча андан ары аннотацияланган (Кошумча маалыматтар 3). Акырында, LA менен BN (1f-сүрөт жана 2-кошумча таблица) жана LA менен HC (3-кошумча сүрөт жана 2-кошумча таблица) үчүн тиешелүүлүгүнө жараша молчулугунда олуттуу айырмачылыктары бар 33 жана 38 аннотацияланган метаболиттер аныкталган. Ал эми, BN менен HCде молчулугунда олуттуу айырмачылыктары бар 3 гана метаболит аныкталган (2-кошумча таблица), бул PLS-DAдагы BN менен HC ортосундагы дал келүүгө дал келет. Бул дифференциалдык метаболиттер биохимиялык заттардын кеңири чөйрөсүн камтыйт (4-кошумча сүрөт). Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар өпкөнүн алгачкы стадиясындагы залалдуу трансформацияны чагылдырган кан сары суусундагы метаболомдогу олуттуу өзгөрүүлөрдү көрсөтөт, алар залалдуу эмес өпкө түйүндөрүнө же дени сак адамдар менен салыштырганда. Ошол эле учурда, BN жана HC кан сары суусундагы метаболоманын окшоштугу залалдуу эмес өпкө түйүндөрү дени сак адамдар менен көптөгөн биологиялык мүнөздөмөлөргө ээ болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Эпидермалдык өсүү факторунун рецепторунун (EGFR) ген мутациялары өпкө аденокарциномасынын 23-түрүндө көп кездешкенин эске алып, биз драйвер мутацияларынын кан сары суусундагы метаболомго тийгизген таасирин аныктоого аракет кылдык. Андан кийин өпкө аденокарциномасы тобундагы EGFR статусу бар 72 учурдун жалпы метаболомикалык профилин талдадык. Кызыктуусу, биз PCA анализинде EGFR мутант бейтаптарынын (n = 41) жана EGFR жапайы типтеги бейтаптардын (n = 31) ортосунда окшош профилдерди таптык (5a-кошумча сүрөт). Бирок, биз EGFR мутациясы бар бейтаптарда жапайы типтеги EGFR менен ооругандарга салыштырмалуу саны бир кыйла өзгөргөн 7 метаболитти аныктадык (t-тест, p < 0,05 жана бүктөмдүн өзгөрүшү > 1,2 же < 0,83) (5b-кошумча сүрөт). Бул метаболиттердин көпчүлүгү (7ден 5) май кислоталарынын кычкылдануу жолдорунда маанилүү ролду ойногон ацилкарнитиндер.
2a-сүрөттө көрсөтүлгөн жумуш агымында көрсөтүлгөндөй, түйүндөрдү классификациялоо үчүн биомаркерлер эң аз абсолюттук кичирейүү операторлорун жана LA (n = 136) жана BN (n = 170) аныкталган 33 дифференциалдык метаболиттерге негизделген тандоону колдонуу менен алынган. Өзгөрмөлөрдүн эң жакшы айкалышы (LASSO) – экилик логистикалык регрессия модели. Моделдин ишенимдүүлүгүн текшерүү үчүн он эселенген кайчылаш валидация колдонулган. Өзгөрмөлөрдү тандоо жана параметрлерди жөнгө салуу λ24 параметри менен ыктымалдуулукту максималдаштыруу жазасы менен жөнгө салынат. Дискриминанттык моделдин классификациялык натыйжалуулугун текшерүү үчүн глобалдык метаболомика анализи андан ары ички валидация (n = 104) жана тышкы валидация (n = 111) топторунда өз алдынча жүргүзүлдү. Натыйжада, ачылыштар топтомундагы 27 метаболит эң чоң орточо AUC маанисине ээ эң мыкты дискриминанттык модель катары аныкталды (2b-сүрөт), алардын ичинен 9 метаболит BNге салыштырмалуу LAда активдүүлүгү жогорулаган жана 18 метаболиттин активдүүлүгү төмөндөгөн (2c-сүрөт).
Өпкө түйүнүнүн классификаторун түзүү боюнча жумуш агымы, анын ичинде он эселенген кайчылаш валидация аркылуу экилик логистикалык регрессия моделин колдонуу менен ачылыш топтомундагы эң жакшы кан сары суу метаболиттери панелин тандоо жана ички жана тышкы валидация топтомдорунда болжолдуу көрсөткүчтөрдү баалоо. b Метаболикалык биомаркерди тандоо үчүн LASSO регрессия моделинин кайчылаш валидация статистикасы. Жогоруда берилген сандар берилген λде тандалган биомаркерлердин орточо санын билдирет. Кызыл пунктир сызык тиешелүү лямбдадагы орточо AUC маанисин билдирет. Боз ката тилкелери минималдуу жана максималдуу AUC маанилерин билдирет. пунктир сызык 27 тандалган биомаркери бар эң жакшы моделди көрсөтөт. AUC, кабыл алуучу иштөө мүнөздөмөсүнүн (ROC) ийри сызыгынын астындагы аянт. c LA тобундагы 27 тандалган метаболиттин ачылыш тобундагы BN тобуна салыштырмалуу бүктөлүүчү өзгөрүүлөрү. Кызыл тилке – активация. Көк тилке төмөндөө болуп саналат. d–f Ачылыш, ички жана тышкы валидация топтомдорундагы 27 метаболит айкалышына негизделген дискриминанттык моделдин күчүн көрсөткөн кабыл алуучу иштөө мүнөздөмөсүнүн (ROC) ийри сызыктары. Баштапкы маалыматтар баштапкы маалыматтардын файлдары түрүндө берилет.
Бул 27 метаболиттин салмакталган регрессиялык коэффициенттеринин негизинде божомолдоо модели түзүлгөн (3-кошумча таблица). Бул 27 метаболитке негизделген ROC анализи ийри сызыктын астындагы аянттын (AUC) мааниси 0,933, ачылыш тобунун сезгичтиги 0,868 жана спецификалуулугу 0,859 болгонун көрсөттү (2d-сүрөт). Ошол эле учурда, LA жана HC ортосундагы 38 аннотацияланган дифференциалдык метаболиттердин ичинен 16 метаболиттин жыйындысы LAны HCден айырмалоодо 0,801 сезгичтиги жана 0,856 спецификалуулугу менен 0,902 AUCке жетишкен (6a-c кошумча сүрөт). Дифференциалдык метаболиттер үчүн ар кандай бүктөмдүн өзгөрүшүнүн босоголоруна негизделген AUC маанилери да салыштырылган. Биз классификация модели бүктөмдүн өзгөрүшүнүн деңгээли 1,2ге каршы 1,5 же 2,0го коюлганда LA жана BN (HC) ортосундагы айырмалоодо эң жакшы натыйжа бергенин аныктадык (7a, b кошумча сүрөт). 27 метаболит тобуна негизделген классификация модели ички жана тышкы когорталарда андан ары текшерилген. Ички валидация үчүн AUC 0,915 (сезгичтик 0,867, спецификалык 0,811) жана тышкы валидация үчүн 0,945 (сезгичтик 0,810, спецификалык 0,979) болгон (2e, f-сүрөт). Лаборатория аралык натыйжалуулукту баалоо үчүн, "Методдор" бөлүмүндө сүрөттөлгөндөй, тышкы когортадан 40 үлгү тышкы лабораторияда талданган. Классификациянын тактыгы AUC 0,925ке жеткен (кошумча 8-сүрөт). Өпкөнүн жалпак клеткалуу карциномасы (LUSC) өпкө аденокарциномасынан (LUAD) кийинки майда клеткалуу эмес өпкө рагынын (NSCLC) экинчи эң кеңири таралган түрү болгондуктан, биз ошондой эле метаболикалык профилдердин валидацияланган потенциалдуу пайдалуулугун текшердик. BN жана LUSCнин 16 учуру. LUSC менен BN ортосундагы айырмалоонун AUC мааниси 0,776 түзгөн (кошумча 9-сүрөт), бул LUAD менен BN ортосундагы айырмалоого салыштырмалуу начарыраак жөндөмдүүлүктү көрсөтүп турат.
Изилдөөлөр көрсөткөндөй, КТ сүрөттөрүндөгү түйүндөрдүн өлчөмү залалдуу шишиктин пайда болуу ыктымалдыгы менен оң корреляцияда жана түйүндөрдү дарылоонун негизги аныктоочу фактору бойдон калууда25,26,27. NELSON скрининг изилдөөсүнүн чоң когортасынан алынган маалыматтарды талдоо көрсөткөндөй, түйүндөрү <5 мм болгон субъекттерде залалдуу шишиктин пайда болуу коркунучу түйүндөрү жок субъекттердегиге окшош болгон28. Ошондуктан, үзгүлтүксүз КТ мониторингин талап кылган минималдуу өлчөм Британ көкүрөк коому (BTS) тарабынан сунушталгандай 5 мм жана Флейшнер коому тарабынан сунушталгандай 6 мм29. Бирок, 6 ммден чоң жана айкын залалдуу белгилери жок, аныкталбаган өпкө түйүндөрү (IPN) деп аталган түйүндөр клиникалык практикада баалоодо жана башкарууда чоң көйгөй бойдон калууда30,31. Андан кийин биз ачылыш жана ички валидация когорталарынан алынган топтоштурулган үлгүлөрдү колдонуп, түйүндөрдүн өлчөмү метаболомикалык кол тамгаларга таасир этеби же жокпу, изилдедик. 27 валидацияланган биомаркерлерге көңүл буруп, биз алгач HC жана BN суб-6 мм метаболомдорунун PCA профилдерин салыштырдык. Биз HC жана BN боюнча маалымат чекиттеринин көпчүлүгү бири-бирине дал келгенин аныктадык, бул эки топтун тең кан сары суусундагы метаболиттердин деңгээли окшош экенин көрсөтүп турат (3a-сүрөт). BN жана LAда ар кандай өлчөмдөгү диапазондордогу өзгөчөлүк карталары сакталып калган (3b-сүрөт, c), ал эми 6–20 мм диапазонунда залалдуу жана залалдуу эмес түйүндөрдүн ортосунда бөлүнүү байкалган (3d-сүрөт). Бул когортада 6дан 20 ммге чейинки түйүндөрдүн залалдуулугун алдын ала айтуу үчүн AUC 0,927, спецификалуулугу 0,868 жана сезгичтиги 0,820 болгон (3e-сүрөт, f). Биздин жыйынтыктар классификатор түйүндүн өлчөмүнө карабастан, эрте залалдуу трансформациядан келип чыккан зат алмашуу өзгөрүүлөрүн чагылдыра аларын көрсөтүп турат.
ad 27 метаболиттен турган метаболикалык классификаторго негизделген көрсөтүлгөн топтордун ортосундагы PCA профилдерин салыштыруу. CC жана BN < 6 мм. b BN < 6 мм vs BN 6–20 мм. LA 6–20 ммде LA 20–30 ммге каршы. g BN 6–20 мм жана LA 6–20 мм. GC, n = 174; BN < 6 мм, n = 153; BN 6–20 мм, n = 91; LA 6–20 мм, n = 89; LA 20–30 мм, n = 77. e 6–20 мм түйүндөр үчүн дискриминанттык моделдин иштешин көрсөткөн кабыл алгычтын иштөө мүнөздөмөсү (ROC) ийри сызыгы. f Ыктымалдуулук маанилери 6–20 мм өлчөмүндөгү түйүндөр үчүн логистикалык регрессия моделинин негизинде эсептелген. Боз чекиттүү сызык оптималдуу чектөө маанисин (0,455) билдирет. Жогорудагы сандар Лос-Анжелес үчүн болжолдонгон учурлардын пайызын билдирет. Эки тараптуу Стьюденттин t-тестин колдонуңуз. PCA, негизги компоненттик анализ. Ийри сызыктын астындагы AUC аянты. Баштапкы маалыматтар баштапкы маалымат файлдары түрүндө берилет.
Сунушталган залалдуу шишикти алдын ала айтуу моделинин иштешин көрсөтүү үчүн өпкө түйүндөрүнүн окшош өлчөмдөрү (7–9 мм) бар төрт үлгү (44–61 жаштагы) тандалып алынган (4a, b-сүрөт). Баштапкы скринингде 1-учур кальцификациясы бар катуу түйүн катары көрсөтүлгөн, бул залалдуу шишик менен байланышкан белги, ал эми 2-учурда эч кандай айкын залалдуу белгилери жок аныкталбаган жарым-жартылай катуу түйүн катары көрсөтүлгөн. Үч айлампадагы кийинки КТ сканерлөөсү бул учурлар 4 жылдык мезгил ичинде туруктуу бойдон калганын жана ошондуктан залалдуу түйүндөр деп эсептелгенин көрсөттү (4a-сүрөт). Сериялык КТ сканерлөөнүн клиникалык баалоосу менен салыштырганда, учурдагы классификатор модели менен бир жолку кан сарысу метаболитинин анализи бул залалдуу түйүндөрдү ыктымалдуулук чектөөлөрүнө негизделген тез жана туура аныктады (1-таблица). 3-учурдагы 4b-сүрөттө көбүнчө залалдуу шишик менен байланышкан плевра ретракциясынын белгилери бар түйүн көрсөтүлгөн32. 4-учурда залалдуу себептин белгилери жок аныкталбаган жарым-жартылай катуу түйүн катары көрсөтүлгөн. Бул учурлардын баары классификатор моделине ылайык залалдуу деп болжолдонгон (1-таблица). Өпкө аденокарциномасынын баалоосу өпкө резекциясы боюнча операциядан кийин гистопатологиялык изилдөө менен көрсөтүлгөн (4b-сүрөт). Тышкы валидация топтому үчүн метаболикалык классификатор 6 ммден чоң белгисиз өпкө түйүндөрүнүн эки учурун так алдын ала айткан (10-кошумча сүрөт).
Залалдуу эмес түйүндөрдүн эки учурунун өпкөсүнүн октук терезесинин КТ сүрөттөрү. 1-учурда, 4 жылдан кийинки КТ оң жак төмөнкү бөлүгүндө кальцификациясы бар 7 мм өлчөмүндөгү туруктуу катуу түйүндү көрсөттү. 2-учурда, 5 жылдан кийинки КТ оң жак жогорку бөлүгүндө диаметри 7 мм болгон туруктуу, жарым-жартылай катуу түйүндү көрсөттү. b Өпкөнүн октук терезе КТ сүрөттөрү жана өпкөнүн резекциясына чейинки I стадиядагы аденокарциноманын эки учурунун тиешелүү патологиялык изилдөөлөрү. 3-учурда оң жак жогорку бөлүгүндө плевра тартылуусу бар диаметри 8 мм болгон түйүн аныкталды. 4-учурда сол жак жогорку бөлүгүндө 9 мм өлчөмүндөгү жарым-жартылай катуу жер айнек түйүнү аныкталды. Резекцияланган өпкө тканынын гематоксилин жана эозин (H&E) боёлушу (масштаб тилкеси = 50 мкм) өпкө аденокарциномасынын ацинардык өсүү схемасын көрсөтөт. Жебелер КТ сүрөттөрүндө аныкталган түйүндөрдү көрсөтөт. H&E сүрөттөрү – бул патологоанатом тарабынан изилденген бир нече (>3) микроскопиялык талаалардын репрезентативдик сүрөттөрү.
Жалпысынан алганда, биздин жыйынтыктар өпкө түйүндөрүнүн дифференциалдык диагнозунда кан сары суусундагы метаболит биомаркерлеринин потенциалдуу маанисин көрсөтөт, бул КТ скринингин баалоодо кыйынчылыктарды жаратышы мүмкүн.
Текшерилген дифференциалдык метаболит панелине таянып, биз негизги зат алмашуу өзгөрүүлөрүнүн биологиялык корреляцияларын аныктоого аракет кылдык. MetaboAnalyst тарабынан жүргүзүлгөн KEGG жолунун байытуу анализи эки берилген топтун ортосундагы 6 жалпы олуттуу өзгөргөн жолду аныктады (LA vs. HC жана LA vs. BN, туураланган p ≤ 0,001, таасири > 0,01). Бул өзгөрүүлөр пируват метаболизминин, триптофан метаболизминин, ниацин жана никотинамид метаболизминин, гликолиздин, TCA циклинин жана пурин метаболизминин бузулушу менен мүнөздөлгөн (5a-сүрөт). Андан кийин биз абсолюттук сандык аныктоону колдонуп, негизги өзгөрүүлөрдү текшерүү үчүн максаттуу метаболомиканы жүргүздүк. Көп өзгөргөн жолдордогу жалпы метаболиттерди анык метаболит стандарттарын колдонуу менен үч квадруполдук массалык спектрометрия (QQQ) аркылуу аныктоо. Метаболомика изилдөөсүнүн максаттуу үлгүсүнүн демографиялык мүнөздөмөлөрү 4-кошумча таблицада келтирилген. Биздин глобалдык метаболомика жыйынтыктарыбызга ылайык, сандык анализ гипоксантин жана ксантин, пируват жана лактаттын LAда BN жана HCге салыштырмалуу көбөйгөнүн тастыктады (5b-сүрөт, c, p <0,05). Бирок, бул метаболиттерде BN менен HC ортосунда эч кандай олуттуу айырмачылыктар табылган жок.
LA тобундагы BN жана HC топторуна салыштырмалуу бир кыйла айырмаланган метаболиттердин KEGG жолунун байытуу анализи. Эки тараптуу Globaltest колдонулуп, p маанилери Holm-Bonferroni ыкмасын колдонуу менен туураланган (жөнгө салынган p ≤ 0,001 жана эффекттин өлчөмү > 0,01). b–d Скрипка графиктери LC-MS/MS менен аныкталган HC, BN жана LA сары суусундагы гипоксантин, ксантин, лактат, пируват жана триптофан деңгээлин көрсөтөт (топ үчүн n = 70). Ак жана кара пунктир сызыктар медиананы жана квартилди тиешелүүлүгүнө жараша көрсөтөт. e LUAD-TCGA маалымат топтомундагы кадимки өпкө тканына (n = 59) салыштырмалуу өпкө аденокарциномасындагы SLC7A5 жана QPRTтин нормалдаштырылган Log2TPM (миллионго транскрипттер) мРНК экспрессиясын (n = 513) көрсөтөт. Ак кутуча квартил аралык диапазонду, борбордогу горизонталдуу кара сызык медиананы, ал эми кутучадан созулган вертикалдуу кара сызык 95% ишеним аралыгын (ИИ) билдирет. f TCGA маалымат топтомунда өпкө аденокарциномасындагы (n = 513) жана кадимки өпкө тканындагы (n = 59) SLC7A5 жана GAPDH экспрессиясынын Пирсон корреляция графиги. Боз аймак 95% ИИни билдирет. r, Пирсон корреляция коэффициенти. g LC-MS/MS менен аныкталган спецификалык эмес shRNA контролу (NC) жана shSLC7A5 (Sh1, Sh2) менен трансфекцияланган A549 клеткаларындагы нормалдаштырылган клеткалык триптофан деңгээли. Ар бир топтогу беш биологиялык көз карандысыз үлгүнүн статистикалык анализи келтирилген. h A549 клеткаларындагы (NC) жана SLC7A5 нокдаун A549 клеткаларындагы (Sh1, Sh2) NADt клеткалык деңгээлдери (жалпы NAD, анын ичинде NAD+ жана NADH). Ар бир топтогу үч биологиялык көз карандысыз үлгүнүн статистикалык анализи келтирилген. i SLC7A5 нокдаунуна чейинки жана андан кийинки A549 клеткаларынын гликолитикалык активдүүлүгү клеткадан тышкаркы кычкылдануу ылдамдыгы (ECAR) менен өлчөнгөн (ар бир топко n = 4 биологиялык жактан көз карандысыз үлгү). 2-DG, 2-дезокси-D-глюкоза. (b–h) бөлүмүндө эки тараптуу Стьюденттин t-тестинин жардамы менен колдонулган. (g–i) бөлүмүндө ката тилкелери орточо ± SDди билдирет, ар бир эксперимент үч жолу өз алдынча жүргүзүлгөн жана натыйжалары окшош болгон. Баштапкы маалыматтар баштапкы маалымат файлдары түрүндө берилген.
LA тобундагы триптофан метаболизминин өзгөрүшүнүн олуттуу таасирин эске алуу менен, биз QQQ колдонуп, HC, BN жана LA топторундагы сывороткадагы триптофандын деңгээлин да бааладык. Биз LAда сывороткадагы триптофан HC же BN менен салыштырганда азайганын аныктадык (p < 0,001, 5d-сүрөт), бул өпкө рагы менен ооруган бейтаптарда триптофандын кандагы деңгээли контролдук топтогу дени сак контролдорго караганда төмөн деген мурунку жыйынтыктарга дал келет33,34,35. ПЭТ/КТ индикатору 11C-метил-L-триптофанды колдонгон дагы бир изилдөөдө өпкө рагы тканындагы триптофан сигналын сактоо убактысы залалсыз жабыркоолорго же кадимки ткандарга салыштырмалуу бир топ жогорулаганы аныкталган36. Биз LA сывороткасындагы триптофандын азайышы өпкө рагы клеткалары тарабынан триптофандын активдүү сиңирилишин чагылдырышы мүмкүн деп божомолдойбуз.
Ошондой эле, триптофан катаболизминин кинуренин жолунун акыркы продуктусу NAD+37,38 экени белгилүү, ал глицеральдегид-3-фосфаттын 1,3-бисфосфоглицерат менен гликолиздеги реакциясы үчүн маанилүү субстрат болуп саналат39. Мурунку изилдөөлөр триптофан катаболизминин иммундук жөнгө салуудагы ролуна багытталган болсо, биз учурдагы изилдөөдө байкалган триптофандын дисрегуляциясы менен гликолитикалык жолдордун ортосундагы өз ара байланышты түшүндүрүүгө аракет кылдык. Эриген заттардын ташуучуларынын 7-мүчөсү 5 (SLC7A5) триптофан ташуучусу экени белгилүү43,44,45. Хинолин кислотасынын фосфорибозилтрансферазасы (QPRT) - бул кинуренин жолунун ылдый жагында жайгашкан, хинолин кислотасын NAMN46га айландыруучу фермент. LUAD TCGA маалыматтар топтомун текшерүү SLC7A5 жана QPRT экөө тең кадимки ткандарга салыштырмалуу шишик ткандарында бир кыйла жогорулаганын көрсөттү (5e-сүрөт). Бул көбөйүү өпкө аденокарциномасынын I жана II стадияларында, ошондой эле III жана IV стадияларында байкалган (11-кошумча сүрөт), бул шишик пайда болушу менен байланышкан триптофан алмашуусунун алгачкы бузулууларын көрсөтүп турат.
Мындан тышкары, LUAD-TCGA маалыматтар топтому рак менен ооругандардын үлгүлөрүндө SLC7A5 жана GAPDH мРНК экспрессиясынын ортосунда оң корреляцияны көрсөттү (r = 0.45, p = 1.55E-26, 5f-сүрөт). Ал эми, кадимки өпкө тканындагы мындай ген кол тамгаларынын ортосунда эч кандай олуттуу корреляция табылган жок (r = 0.25, p = 0.06, 5f-сүрөт). A549 клеткаларындагы SLC7A5тин (кошумча 12-сүрөт) нокдауну клеткалык триптофандын жана NAD(H) деңгээлин бир кыйла төмөндөттү (5g,h-сүрөт), бул клеткадан тышкаркы кычкылдануу ылдамдыгы (ECAR) менен өлчөнгөндөй гликолитикалык активдүүлүктүн басаңдашына алып келди (1-сүрөт). 5i). Ошентип, кан сары суусундагы жана in vitro аныктоодогу зат алмашуу өзгөрүүлөрүнө таянып, биз триптофандын метаболизми кинуренин жолу аркылуу NAD+ пайда кылышы жана өпкө рагында гликолизди күчөтүүдө маанилүү ролду ойношу мүмкүн деген гипотеза чыгарабыз.
Изилдөөлөр көрсөткөндөй, LDCT аркылуу аныкталган көптөгөн белгисиз өпкө түйүндөрү ПЭТ-КТ, өпкө биопсиясы жана залалдуу шишиктин жалган оң диагнозунан улам ашыкча дарылоо сыяктуу кошумча текшерүүлөрдү жүргүзүү зарылдыгына алып келиши мүмкүн.31 6-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, биздин изилдөө КТ аркылуу аныкталган өпкө түйүндөрүнүн тобокелдик стратификациясын жана андан ары башкарууну жакшыртышы мүмкүн болгон потенциалдуу диагностикалык мааниси бар кан сары суусундагы метаболиттердин панелин аныктады.
Өпкө түйүндөрү залалдуу же залалдуу себептерди көрсөткөн сүрөткө тартуу өзгөчөлүктөрү менен аз дозалуу компьютердик томография (LDCT) аркылуу бааланат. Түйүндөрдүн белгисиз натыйжасы тез-тез кайталап кайрылууга, керексиз кийлигишүүлөргө жана ашыкча дарылоого алып келиши мүмкүн. Диагностикалык мааниси бар кан сары суусундагы зат алмашуу классификаторлорун кошуу өпкө түйүндөрүнүн тобокелдигин баалоону жана андан ары башкарууну жакшыртышы мүмкүн. ПЭТ позитрондук-эмиссиялык томография.
АКШнын NLST изилдөөсүнүн жана Европалык NELSON изилдөөсүнүн маалыматтары жогорку тобокелдик топторун аз дозалуу компьютердик томография (LDCT) менен текшерүү өпкө рагынан өлүмдү азайтышы мүмкүн экенин көрсөтүп турат1,3. Бирок, LDCT аркылуу аныкталган көп сандагы кокустук өпкө түйүндөрүн тобокелдикти баалоо жана андан кийинки клиникалык башкаруу эң татаал бойдон калууда. Негизги максат - ишенимдүү биомаркерлерди киргизүү менен LDCTге негизделген протоколдордун туура классификациясын оптималдаштыруу.
Кан метаболиттери сыяктуу айрым молекулярдык биомаркерлер өпкө рагын дени сак контролдук топ менен салыштыруу аркылуу аныкталган15,17. Учурдагы изилдөөдө биз LDCT аркылуу кокустан аныкталган залалдуу жана залалдуу өпкө түйүндөрүн айырмалоо үчүн кан сары суусунун метаболомикасын анализдөөгө көңүл бурдук. Биз UPLC-HRMS анализин колдонуп, дени сак контролдук топтун (HC), залалдуу өпкө түйүндөрүнүн (BN) жана I стадиядагы өпкө аденокарциномасынын (LA) үлгүлөрүнүн глобалдык кан сары суусунун метаболомасын салыштырдык. Биз HC жана BN окшош метаболикалык профилдерге ээ экенин, ал эми LA HC жана BNге салыштырмалуу олуттуу өзгөрүүлөрдү көрсөткөнүн аныктадык. Биз LAны HC жана BNден айырмалаган эки кан сары суусунун метаболиттерин аныктадык.
Азыркы LDCT негизиндеги залалдуу жана залалдуу түйүндөрдү аныктоо схемасы негизинен түйүндөрдүн көлөмүнө, тыгыздыгына, морфологиясына жана убакыттын өтүшү менен өсүү ылдамдыгына негизделген30. Мурунку изилдөөлөр түйүндөрдүн өлчөмү өпкө рагынын пайда болуу ыктымалдыгы менен тыгыз байланышта экенин көрсөттү. Жогорку тобокелдиктеги бейтаптарда да, <6 мм түйүндөрдөгү залалдуу шишиктин пайда болуу коркунучу <1% түзөт. 6дан 20 ммге чейинки түйүндөрдөгү залалдуу шишиктин пайда болуу коркунучу 8%дан 64%га чейин30. Ошондуктан, Флейшнер коому кадимки КТ байкоосу үчүн кесүү диаметрин 6 мм деп сунуштайт.29 Бирок, 6 ммден чоң белгисиз өпкө түйүндөрүнүн (IPN) тобокелдигин баалоо жана башкаруу жетиштүү деңгээлде жүргүзүлгөн эмес31. Тубаса жүрөк оорусун учурдагы башкаруу, адатта, тез-тез КТ мониторинги менен сергек күтүүгө негизделген.
Текшерилген метаболомага таянып, биз биринчи жолу дени сак адамдар менен <6 мм залалдуу эмес түйүндөр ортосундагы метаболомикалык белгилердин дал келүүсүн көрсөттүк. Биологиялык окшоштук мурунку КТ жыйынтыктарына дал келет, анда <6 мм түйүндөр үчүн залалдуу шишик коркунучу түйүндөрү жок субъектилердегидей эле төмөн.30 Белгилей кетүүчү нерсе, биздин жыйынтыктар ошондой эле <6 мм жана ≥6 мм залалдуу эмес түйүндөр метаболомикалык профилдерде жогорку окшоштукка ээ экенин көрсөтүп турат, бул залалдуу эмес этиологиянын функционалдык аныктамасы түйүндүн өлчөмүнө карабастан ырааттуу экенин көрсөтүп турат. Ошентип, заманбап диагностикалык кан сарысу метаболит панелдери КТда түйүндөр алгач аныкталганда бир гана анализди жокко чыгаруу тести катары камсыз кылып, сериялык мониторингди азайтышы мүмкүн. Ошол эле учурда, ошол эле метаболикалык биомаркерлер панели өлчөмү ≥6 мм болгон залалдуу түйүндөрдү залалдуу эмес түйүндөрдөн айырмалап, окшош өлчөмдөгү IPN жана КТ сүрөттөрүндө түшүнүксүз морфологиялык белгилер үчүн так божомолдорду берди. Бул кан сарысу метаболизминин классификатору ≥6 мм түйүндөрдүн залалдуу шишигин AUC 0,927 менен алдын ала айтууда жакшы натыйжа берди. Жыйынтыктап айтканда, биздин жыйынтыктар көрсөткөндөй, уникалдуу кан сары суусундагы метаболикалык кол тамгалар шишиктин алгачкы зат алмашуу өзгөрүүлөрүн чагылдырышы мүмкүн жана түйүндөрдүн көлөмүнө карабастан, тобокелдикти алдын ала айтуучулар катары потенциалдуу мааниге ээ болушу мүмкүн.
Белгилей кетчү нерсе, өпкө аденокарциномасы (LUAD) жана жалпак клеткалуу карцинома (LUSC) майда клеткалуу эмес өпкө рагынын (NSCLC) негизги түрлөрү болуп саналат. LUSC тамеки чегүү менен тыгыз байланышта экенин47 жана LUAD компьютердик томографияда аныкталган кокустук өпкө түйүндөрүнүн эң көп кездешкен гистологиясы экенин48 эске алганда, биздин классификатор моделибиз I стадиядагы аденокарцинома үлгүлөрү үчүн атайын түзүлгөн. Ван жана кесиптештери ошондой эле LUADга көңүл буруп, өпкөнүн алгачкы стадиясындагы рагын дени сак адамдардан айырмалоо үчүн липидомиканы колдонуп, тогуз липиддик белгини аныкташкан17. Биз учурдагы классификатор моделин I стадиядагы LUSC жана 74 залалсыз түйүндөр боюнча 16 учурда сынап көрдүк жана LUSC божомолунун төмөн тактыгын (AUC 0.776) байкадык, бул LUAD менен LUSCтин өздөрүнүн метаболомикалык белгилери болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Чынында эле, LUAD менен LUSC этиологиясы, биологиялык келип чыгышы жана генетикалык аномалиялары боюнча айырмаланары көрсөтүлгөн49. Ошондуктан, скрининг программаларында өпкө рагын популяцияга негизделген аныктоо боюнча окутуу моделдерине гистологиянын башка түрлөрү киргизилиши керек.
Бул жерде биз дени сак контролдук топко жана залалсыз түйүндөргө салыштырмалуу өпкө аденокарциномасында эң көп өзгөргөн алты жолду аныктадык. Ксантин жана гипоксантин пурин алмашуу жолунун кеңири таралган метаболиттери болуп саналат. Биздин жыйынтыктарга ылайык, пурин алмашуусу менен байланышкан ортоңку заттар өпкө аденокарциномасы менен ооругандардын кан сары суусунда же ткандарында дени сак контролдук топко же инвазивдик стадиядагы бейтаптарга салыштырмалуу бир кыйла көбөйгөн15,50. Кан сары суусундагы ксантин менен гипоксантиндин деңгээлинин жогорулашы тез көбөйүүчү рак клеткалары талап кылган анаболизмди чагылдырышы мүмкүн. Глюкоза алмашуусунун бузулушу рак алмашуусунун белгилүү белгиси болуп саналат51. Бул жерде биз HC жана BN тобуна салыштырмалуу LA тобунда пируват менен лактаттын олуттуу көбөйүшүн байкадык, бул майда клеткалуу эмес өпкө рагы (NSCLC) менен ооругандардын жана дени сак контролдук топтун кан сары суусундагы метаболом профилдериндеги гликолитикалык жолдун аномалиялары жөнүндө мурунку билдирүүлөргө дал келет. жыйынтыктар бирдиктүү52,53.
Маанилүүсү, биз өпкө аденокарциномаларынын кан сары суусундагы пируват менен триптофандын метаболизминин ортосундагы тескери корреляцияны байкадык. LA тобунда кан сары суусундагы триптофандын деңгээли HC же BN тобуна салыштырмалуу төмөндөгөн. Кызыктуусу, проспективдүү когортаны колдонуу менен жүргүзүлгөн мурунку ири масштабдуу изилдөөдө кан айлануудагы триптофандын төмөн деңгээли өпкө рагынын коркунучунун жогорулашы менен байланыштуу экени аныкталган 54. Триптофан - биз толугу менен тамак-аштан алган маанилүү аминокислота. Биз өпкө аденокарциномасындагы кан сары суусундагы триптофандын азайышы бул метаболиттин тез азайышын чагылдырышы мүмкүн деген тыянакка келдик. Кинуренин жолу аркылуу триптофандын катаболизминин акыркы продуктусу de novo NAD+ синтезинин булагы экени белгилүү. NAD+ негизинен рекуперация жолу аркылуу өндүрүлгөндүктөн, ден соолукта жана ооруда триптофандын метаболизминдеги NAD+ мааниси аныктала элек46. TCGA маалымат базасын талдообуз көрсөткөндөй, триптофан ташуучу эритме ташуучу 7A5тин (SLC7A5) экспрессиясы өпкө аденокарциномасында кадимки контролдук топко салыштырмалуу бир кыйла жогорулаган жана GAPDH гликолитикалык ферментинин экспрессиясы менен оң корреляцияланган. Мурунку изилдөөлөр негизинен триптофан катаболизминин шишикке каршы иммундук жоопту басуудагы ролуна багытталган40,41,42. Бул жерде биз өпкө рагы клеткаларында SLC7A5ти нокдаун кылуу менен триптофандын сиңүүсүн басуу клеткалык NAD деңгээлинин төмөндөшүнө жана гликолитикалык активдүүлүктүн басаңдашына алып келерин көрсөтөбүз. Кыскасы, биздин изилдөө өпкө аденокарциномасынын залалдуу трансформациясы менен байланышкан кан сары суусундагы метаболизмдин өзгөрүшүнүн биологиялык негизин берет.
EGFR мутациялары NSCLC менен ооругандарда эң көп кездешкен кыймылдаткыч мутациялар болуп саналат. Биздин изилдөөдө EGFR мутациясы бар бейтаптардын (n = 41) жалпы метаболикалык профилдери жапайы типтеги EGFR (n = 31) менен ооругандарга окшош экенин аныктадык, бирок ацилкарнитин менен ооругандардын айрым EGFR мутанттарынын кан сары суусундагы деңгээлинин төмөндөгөнүн байкадык. Ацилкарнитиндердин белгиленген функциясы - ацил топторун цитоплазмадан митохондриялык матрицага ташуу, бул май кислоталарынын кычкылдануусуна алып келип, энергия 55 өндүрөт. Биздин жыйынтыктарга ылайык, жакында жүргүзүлгөн бир изилдөөдө 102 өпкө аденокарциномасынын тканынын үлгүлөрүнүн глобалдык метаболомун талдоо менен EGFR мутанты менен EGFR жапайы типтеги шишиктердин ортосундагы окшош метаболомдук профилдер аныкталган50. Кызыктуусу, ацилкарнитиндин курамы EGFR мутанттар тобунда да табылган. Ошондуктан, ацилкарнитин деңгээлиндеги өзгөрүүлөр EGFR тарабынан индукцияланган метаболикалык өзгөрүүлөрдү жана анын негизиндеги молекулярдык жолдорду чагылдырабы же жокпу, андан ары изилдөөгө арзыйт.
Жыйынтыктап айтканда, биздин изилдөө өпкө түйүндөрүнүн дифференциалдык диагнозу үчүн кан сары суусундагы зат алмашуу классификаторун түзөт жана КТ скринингинин негизинде тобокелдикти баалоону оптималдаштырып, клиникалык башкарууну жеңилдетүүчү жумуш агымын сунуштайт.
Бул изилдөө Сунь Ятсен университетинин онкологиялык ооруканасынын Этика комитети, Сунь Ятсен университетинин биринчи филиалдык ооруканасы жана Чжэнчжоу университетинин онкологиялык ооруканасынын Этика комитети тарабынан бекитилген. Ачылыш жана ички валидация топторунда Сунь Ятсен университетинин онкологиялык борборунун онкологиялык көзөмөл жана алдын алуу бөлүмүндө жыл сайын медициналык кароодон өтүп жаткан адамдардан дени сак адамдардан 174 кан сары суусу жана залалсыз түйүндөрдөн 244 кан сары суусу жана Сунь Ятсен университетинин онкологиялык борборунан 166 залалсыз түйүн чогултулган. I стадиядагы өпкө аденокарциномалары Сунь Ятсен университетинин онкологиялык борборунан чогултулган. Тышкы валидация когортасында залалсыз түйүндөрдүн 48 учуру, Сунь Ятсен университетинин биринчи филиалдык ооруканасынан 39 I стадиядагы өпкө аденокарциномасы жана Чжэнчжоу онкологиялык ооруканасынан 24 I стадиядагы өпкө аденокарциномасы болгон. Сунь Ятсен университетинин онкологиялык борбору ошондой эле белгиленген метаболикалык классификатордун диагностикалык жөндөмүн текшерүү үчүн I стадиядагы жалпак клеткалуу өпкө рагынын 16 учурун чогулткан (бейтаптын мүнөздөмөлөрү 5-кошумча таблицада көрсөтүлгөн). Ачылыш когортасынан жана ички валидация когортасынан үлгүлөр 2018-жылдын январынан 2020-жылдын майына чейин чогултулган. Тышкы валидация когортасы үчүн үлгүлөр 2021-жылдын августунан 2022-жылдын октябрына чейин чогултулган. Гендердик калыс эместикти азайтуу үчүн ар бир когортага болжол менен бирдей сандагы эркектер менен аялдардын учурлары дайындалган. Ачылыш тобу жана Ички кароо тобу. Катышуучунун жынысы өзүн-өзү билдирүүнүн негизинде аныкталган. Бардык катышуучулардан маалымдуу макулдук алынган жана эч кандай компенсация берилген эмес. Залалдуу эмес түйүндөрү бар субъектилер анализ учурунда 2 жылдан 5 жылга чейин туруктуу КТ упайына ээ болгондор болгон, операцияга чейин чогултулган жана гистопатология менен диагноз коюлган тышкы валидация үлгүсүнөн 1 учурду кошпогондо. Өнөкөт бронхитти кошпогондо. Өпкө аденокарциномасынын учурлары өпкөнүн резекциясынан мурун чогултулуп, патологиялык диагноз менен тастыкталган. Ачка кан үлгүлөрү эч кандай антикоагулянттарсыз сыворотканы бөлүүчү түтүкчөлөрдө чогултулган. Кан үлгүлөрү бөлмө температурасында 1 саат бою уюп, андан кийин сыворотканын үстүнкү катмарын чогултуу үчүн 2851 × g ылдамдыгында 4°C температурада 10 мүнөт центрифугаланган. Сыворотканын аликвоталары метаболит экстракцияланганга чейин -80°C температурада тоңдурулган. Сунь Ятсен университетинин онкологиялык борборунун Рактын алдын алуу жана медициналык экспертиза бөлүмү 40 жаштан 55 жашка чейинки эркектер менен аялдардын бирдей санын камтыган 100 дени сак донордон сыворотканын пулун чогулткан. Ар бир донордун үлгүсүнүн бирдей көлөмдөрү аралаштырылган, алынган пул аликвотацияланган жана -80°C температурада сакталган. Сыворотканын аралашмасы сапатты көзөмөлдөө жана маалыматтарды стандартташтыруу үчүн эталондук материал катары колдонулган.
Сыворотка жана сыноо үлгүлөрү эритилип, метаболиттер айкалышкан экстракция ыкмасы (MTBE/метанол/суу) 56 колдонулуп экстракцияланган. Кыскача айтканда, 50 мкл сыворотка 225 мкл муздак метанол жана 750 мкл муздак метилтрет-бутил эфири (MTBE) менен аралаштырылган. Аралашманы аралаштырып, музда 1 саат инкубациялаңыз. Андан кийин үлгүлөр аралаштырылып, ички стандарттарды (13C-лактат, 13C3-пируват, 13C-метионин жана 13C6-изолейцин) камтыган 188 мкл MS класстагы суу менен аралаштырылган, алар Cambridge Isotope Laboratories компаниясынан сатылып алынган. Андан кийин аралашма 15 000 × g ылдамдыкта 4°C температурада 10 мүнөт центрифугаланган, ал эми төмөнкү фаза оң жана терс режимдерде LC-MS анализи үчүн эки пробиркага (ар бири 125 мкл) которулган. Акырында, үлгү жогорку ылдамдыктагы вакуумдук концентратордо кургаганга чейин бууландырылды.
Кургатылган метаболиттер 120 мкл 80% ацетонитрилде калыбына келтирилип, 5 мүнөт аралаштырылып, 4°C температурада 10 мүнөт 15000 × g ылдамдыкта центрифугаланган. Супернатанттар метаболомиканы изилдөө үчүн микрокошумчалары бар янтарь айнек флакондорго куюлган. Өтө натыйжалуу суюк хроматография-жогорку чечилиштеги массалык спектрометрия (UPLC-HRMS) платформасында максатсыз метаболомиканы талдоо. Метаболиттер Dionex Ultimate 3000 UPLC системасы жана ACQUITY BEH амид колонкасы (2.1 × 100 мм, 1.7 мкм, Уотерс) аркылуу бөлүнгөн. Оң ион режиминде кыймылдуу фазалар 95% (A) жана 50% ацетонитрил (B) болгон, алардын ар бири 10 ммоль/л аммоний ацетатын жана 0.1% кумурска кислотасын камтыган. Терс режимде, А жана В кыймылдуу фазаларында тиешелүүлүгүнө жараша 95% жана 50% ацетонитрил болгон, эки фазада тең 10 ммоль/л аммоний ацетаты болгон, рН = 9. Градиент программасы төмөнкүдөй болгон: 0–0,5 мин, 2% B; 0,5–12 мин, 2–50% B; 12–14 мин, 50–98% B; 14–16 мин, 98% B; 16–16,1 мин, 98–2% B; 16,1–20 мин, 2% B. Автосамплердеги колонка 40°C температурада, ал эми үлгү 10°C температурада кармалган. Агым ылдамдыгы 0,3 мл/мин, инъекция көлөмү 3 мкл болгон. Электрочачыраткыч иондоштуруу (ESI) булагы бар Q-Exactive Orbitrap массалык спектрометри (Thermo Fisher Scientific) толук сканерлөө режиминде иштетилип, чоң көлөмдөгү маалыматтарды чогултуу үчүн ddMS2 мониторинг режими менен бириктирилген. MS параметрлери төмөнкүдөй коюлган: чачыратуу чыңалуу +3,8 кВ/- 3,2 кВ, капиллярдык температура 320°C, коргоочу газ 40 арб, көмөкчү газ 10 арб, зонд жылыткычынын температурасы 350°C, сканерлөө диапазону 70–1050 м/саат, чечилиш 70 000. Маалыматтар Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) колдонуу менен алынган.
Маалыматтардын сапатын баалоо үчүн, ар бир үлгүдөн үстүнкү катмардын 10 мкл аликвотасын алып салуу менен топтолгон сапатты көзөмөлдөө (СК) үлгүлөрү алынган. UPLC-MS системасынын туруктуулугун баалоо үчүн аналитикалык ырааттуулуктун башында алты сапатты көзөмөлдөө үлгүсүн инъекциялоо талданган. Андан кийин сапатты көзөмөлдөө үлгүлөрү партияга мезгил-мезгили менен киргизилип турат. Бул изилдөөдөгү кан сары суусунун үлгүлөрүнүн бардык 11 партиясы LC-MS аркылуу талданган. Экстракция процессин көзөмөлдөө жана партиядан партияга тийгизген таасирин жөнгө салуу үчүн тиешелүү партияларда 100 дени сак донордон алынган кан сары суусунун аралашмасынын аликвоталары эталондук материал катары колдонулган. Сунь Ятсен университетинин Метаболомика борборунда ачылыш когортасынын, ички валидация когортасынын жана тышкы валидация когортасынын максатсыз метаболомикалык анализи жүргүзүлдү. Гуандун технологиялык университетинин анализ жана сыноо борборунун тышкы лабораториясы классификатор моделинин иштешин текшерүү үчүн тышкы когортадан 40 үлгүнү да талдаган.
Экстракциядан жана калыбына келтирүүдөн кийин, кан сары суусундагы метаболиттердин абсолюттук саны көп реакциялык мониторинг (MRM) режиминде электроспрей иондоштуруу (ESI) булагы менен өтө жогорку натыйжалуу суюк хроматография-тандемдик массалык спектрометрия (Agilent 6495 үч квадрупол) аркылуу өлчөнгөн. Метаболиттерди бөлүү үчүн ACQUITY BEH амид тилкеси (2.1 × 100 мм, 1.7 мкм, Уотерс) колдонулган. Мобилдик фаза 90% (A) жана 10 ммоль/л аммоний ацетаты жана 0.1% аммиак эритмеси кошулган 5% ацетонитрилден (B) турган. Градиент программасы төмөнкүдөй болгон: 0–1.5 мин, 0% B; 1.5–6.5 мин, 0–15% B; 6.5–8 мин, 15% B; 8–8.5 мин, 15%–0% B; 8.5–11.5 мин, 0%B. Автосамплердеги колонка 40 °C, ал эми үлгү 10 °C температурада кармалып турган. Агым ылдамдыгы 0,3 мл/мин, ал эми сайуу көлөмү 1 мкл болгон. MS параметрлери төмөнкүдөй коюлган: капиллярдык чыңалуу ±3,5 кВ, небулайзердин басымы 35 psi, кабык газынын агымы 12 л/мин, кабык газынын температурасы 350°C, кургатуучу газдын температурасы 250°C жана кургатуучу газдын агымы 14 л/мин. Триптофандын, пируваттын, лактаттын, гипоксантиндин жана ксантиндин MRM конверсиялары тиешелүүлүгүнө жараша 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 жана 151,0–107,9 түзгөн. Маалыматтар Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) колдонуу менен чогултулган. Кан сары суусунун үлгүлөрү үчүн триптофан, пируват, лактат, гипоксантин жана ксантин стандарттык аралашма эритмелеринин калибрлөө ийри сызыктарын колдонуу менен сандык жактан аныкталган. Клетка үлгүлөрү үчүн триптофандын курамы ички стандартка жана клетка белок массасына нормалдаштырылган.
Чоку экстракциясы (м/з жана кармоо убактысы (RT)) Compound Discovery 3.1 жана TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) колдонуу менен жүргүзүлдү. Партиялардын ортосундагы потенциалдуу айырмачылыктарды жок кылуу үчүн, салыштырмалуу молчулукту алуу үчүн сыноо үлгүсүнүн ар бир мүнөздүү чоку ошол эле партиядан алынган эталондук материалдын мүнөздүү чокусуна бөлүндү. Стандартташтырууга чейинки жана андан кийинки ички стандарттардын салыштырмалуу стандарттык четтөөлөрү 6-кошумча таблицада көрсөтүлгөн. Эки топтун ортосундагы айырмачылыктар жалган ачылыш ылдамдыгы (FDR<0.05, Уилкоксондун кол коюлган ранг тести) жана бүктөмдүн өзгөрүшү (>1.2 же <0.83) менен мүнөздөлгөн. Алынган өзгөчөлүктөрдүн чийки MS маалыматтары жана эталондук сыворотка менен коррекцияланган MS маалыматтары тиешелүүлүгүнө жараша 1-кошумча маалыматтарда жана 2-кошумча маалыматтарда көрсөтүлгөн. Чоку аннотациясы аныкталган метаболиттер, болжолдуу аннотацияланган кошулмалар, болжолдуу мүнөздөлгөн кошулма класстары жана белгисиз кошулмалар 22 сыяктуу төрт аныкталган идентификация деңгээлине негизделип жүргүзүлдү. Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) маалымат базасын издөөлөрдүн негизинде, акыры дифференциалдык метаболоманын ортосундагы аралык катары MS/MS дал келген же mzCloud (балл > 85) же Chemspiderдеги так дал келүү аннотациялары бар биологиялык кошулмалар тандалып алынды. Ар бир өзгөчөлүк үчүн эң жогорку аннотациялар Кошумча маалыматтар 3кө киргизилген. MetaboAnalyst 5.0 суммалык нормалаштырылган метаболиттердин көптүгүнүн бир өзгөрмөлүү анализи үчүн колдонулган. MetaboAnalyst 5.0 ошондой эле KEGG жолунун байытуу анализин бир кыйла айырмаланган метаболиттерге негизделген баалаган. Негизги компоненттик анализ (PCA) жана жарым-жартылай эң кичине квадраттар дискриминанттык анализи (PLS-DA) ropls программалык пакетин (v.1.26.4) стек нормалаштыруу жана автомасштабдоо менен колдонуп талданган. Түйүндүн залалдуулугун алдын ала айтуу үчүн оптималдуу метаболит биомаркер модели эң аз абсолюттук кичирейүү жана тандоо оператору менен экилик логистикалык регрессияны колдонуу менен түзүлгөн (LASSO, R пакети v.4.1-3). Дискриминанттык моделдин аныктоо жана валидация топтомдорундагы иштеши pROC пакетине (v.1.18.0.) ылайык ROC анализине негизделген AUC баалоо менен мүнөздөлгөн. Оптималдуу ыктымалдуулук чеги моделдин максималдуу Юден индексинин негизинде алынган (сезгичтик + спецификалык – 1). Босогодон төмөн же жогору мааниге ээ үлгүлөр тиешелүүлүгүнө жараша залалсыз түйүндөр жана өпкө аденокарциномасы катары болжолдонот.
A549 клеткалары (#CCL-185, Америкалык типтеги культуралар жыйнагы) 10% FBS камтыган F-12K чөйрөсүндө өстүрүлдү. SLC7A5ти бутага алган кыска чачтуу РНК (shRNA) ырааттуулугу жана бутага албаган контролдук (NC) лентивирустук вектор pLKO.1-puroго киргизилген. shSLC7A5тин антисенс ырааттуулугу төмөнкүдөй: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). SLC7A5ке (#5347) жана тубулинге (#2148) каршы антителолор Cell Signaling Technology компаниясынан сатылып алынган. SLC7A5ке жана тубулинге каршы антителолор Western blot анализи үчүн 1:1000 суюлтуу менен колдонулган.
Seahorse XF гликолитикалык стресс-тест клеткадан тышкаркы кычкылдануу (ECAR) деңгээлин өлчөйт. Анализде ECAR менен өлчөнгөн клеткалык гликолитикалык кубаттуулукту текшерүү үчүн глюкоза, олигомицин А жана 2-DG ырааттуу түрдө берилген.
Максаттуу эмес контролдук (NC) жана shSLC7A5 (Sh1, Sh2) менен трансфекцияланган A549 клеткалары диаметри 10 см идиштерге түнү бою куюлган. Клетка метаболиттери 1 мл муздак 80% суулуу метанол менен экстракцияланган. Метанол эритмесиндеги клеткалар кырылып алынып, жаңы түтүккө чогултулуп, 15 000 × g ылдамдыкта 4°C температурада 15 мүнөт центрифугаланган. 800 мкл үстүнкү катмарды чогултуп, жогорку ылдамдыктагы вакуумдук концентраторду колдонуп кургатыңыз. Андан кийин кургатылган метаболит гранулдары жогоруда сүрөттөлгөндөй LC-MS/MS колдонуп триптофандын деңгээлине талданган. A549 клеткаларындагы (NC жана shSLC7A5) клеткалык NAD(H) деңгээли өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык сандык NAD+/NADH колориметриялык комплекти (#K337, BioVision) менен өлчөнгөн. Метаболиттердин көлөмүн нормалдаштыруу үчүн ар бир үлгү үчүн белоктун деңгээли өлчөнгөн.
Үлгү өлчөмүн алдын ала аныктоо үчүн эч кандай статистикалык ыкмалар колдонулган эмес. Биомаркерлерди ачууга багытталган мурунку метаболомика изилдөөлөрү15,18 өлчөмдү аныктоо үчүн эталон катары каралган жана бул отчеттор менен салыштырганда, биздин үлгү жетиштүү болгон. Изилдөө когортасынан эч кандай үлгүлөр чыгарылган эмес. Кан сары суусунун үлгүлөрү максаттуу эмес метаболомика изилдөөлөрү үчүн кокустук түрдө ачылыш тобуна (306 учур, 74,6%) жана ички валидация тобуна (104 учур, 25,4%) дайындалган. Ошондой эле, максаттуу метаболомика изилдөөлөрү үчүн ачылыштар топтомунан ар бир топтон 70 учурду кокустук түрдө тандап алдык. Изилдөөчүлөр LC-MS маалыматтарын чогултуу жана талдоо учурунда топтук дайындоого көз жумган. Метаболомика маалыматтарынын жана клеткалык эксперименттердин статистикалык анализдери тиешелүү Жыйынтыктар, Сүрөт Легендалары жана Методдор бөлүмдөрүндө баяндалган. Клеткалык триптофандын, NADTтин жана гликолитикалык активдүүлүктүн сандык баалоосу бирдей натыйжалар менен үч жолу көз карандысыз жүргүзүлдү.
Изилдөөнүн дизайны жөнүндө көбүрөөк маалымат алуу үчүн, ушул макалага байланыштуу Табигый портфолио отчетунун кыскача мазмунун караңыз.
Алынган өзгөчөлүктөрдүн чийки MS маалыматтары жана эталондук сыворотканын нормалдаштырылган MS маалыматтары тиешелүү түрдө Кошумча маалыматтар 1 жана Кошумча маалыматтар 2де көрсөтүлгөн. Дифференциалдык өзгөчөлүктөр үчүн эң жогорку аннотациялар Кошумча маалыматтар 3тө берилген. LUAD TCGA маалыматтар топтомун https://portal.gdc.cancer.gov/ дарегинен жүктөп алса болот. Графикти чийүү үчүн киргизүү маалыматтары баштапкы маалыматтарда берилген. Баштапкы маалыматтар ушул макала үчүн берилген.
Улуттук өпкө скринингин изилдөө тобу ж.б. Төмөн дозалуу компьютердик томография менен өпкө рагынан өлүмдү азайтуу. Түндүк Англия. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Крамер, Б.С., Берг, К.Д., Аберле, Д.Р. жана Пропет, П.К. Аз дозадагы спираль формасындагы КТ колдонуу менен өпкө рагын скринингдөө: Улуттук өпкө скрининг изилдөөсүнүн (NLST) жыйынтыктары. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
Де Конинг, Х.Ж. жана башкалар. Рандомизацияланган сыноодо көлөмдүү КТ скрининги менен өпкө рагынан өлүмдү азайтуу. Түндүк Англия. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Жарыяланган убактысы: 2023-жылдын 18-сентябры